Browsing by Author "Alves Oliveira, Sofia Raquel"

Now showing 1 - 3 of 3

HPLC analysis of bacterial alarmone nucleotide (p)ppGpp and its toxic analogue ppApp
(2020-09-11) Alves Oliveira, Sofia Raquel; Tenson, Tanel, juhendaja; Hauryliuk, Vasili, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Bakteritel on evolutsiooni käigus välja kujunenud arvukalt kohanemismehhanisme, mis aitavad neil ellu jääda ka karmides keskkonnatingimustes. Keerukad molekulaarsed võrgustikud kontrollivad adaptiivseid füsioloogilisi vastuseid, näiteks antibiootikumiresistentsust, biokile moodustumist ja bakterite minekut uinunud olekusse. Sellised kohanemismehhanismid sõltuvad stressi tajuvate ja sellele reageerivate valkude ensümaatilistest aktiivsustest. Üheks oluliseks komponendiks stressivastuses on signaalmolekulide süntees ja lagundamine. Käesolevas töös uuriti ühte kõige laiemalt levinud adaptiivset mehhanismi, mida nimetatakse poomisvastuseks. Selle mehhanismi puhul on võtmetähtsusega RelA / SpoT homoloogsed (RSH) ensüümid, mis sünteesivad ja lagundavad alarmoon-nukleotiide ppGpp ja ppp(G)pp. Nende nukleotiidide ühiseks nimetamiseks kasutatakse tähistust (p)ppGpp. Need molekulid mõjutavad mitmeid protsesse bakterirakus, näiteks virulentsust ja antibiootikumitolerantsust. Käesoleva töö eesmärgiks oli välja töötada metoodika nukleotiidide, sealhulgas (p)ppGpp, tasemete kvantifitseerimiseks. Rakendades seda metoodikat uuriti nukleotiidide taset bakterite kasvul ning antibiootikumitöötluse käigus. Nukleotiidide, sealhulgas (p)ppGpp taseme kvantifitseerimiseks töötati välja HPLC-l põhinev meetod. Nukleotiidide kvantifitseerimise meetodid sisaldavad kolme etappi: proovi kogumine, nukleotiidide ekstraheerimine ja kvantifitseerimine. Kogumisetapis filtreeriti bakterikultuur ja nukleotiidide ekstraheerimiseks viidi filter äädikhappesse. (p)ppGpp kvantifitseerimiseks rakendati HPLC metoodikat 5 µm 4,6 x 150 mm tugeval anioonvahetuskolonnil. Teiste nukleotiidide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati ioon-paar pöördfaasi (IPRP) kromatograafiat Kinetex C18 2,6 µm 4,6 x 150 mm kolonnil. Kasutades väljatöötatud metoodikaid uuriti nukleotiidide tasemete muutust bakterite stressivastuse korral. Soolekepikesel (Escherichia coli) analüüsiti nukleotiidide tasemeid kasvukõvera erinevates faasides ja aminohapete nälja puhul. Aminohapete nälja puhul täheldati kiiret (p)ppGpp taseme tõusu. Translatsiooni inhibeerivate antibiootikumide (tiostreptooni, klooramfenikooli ja tetratsükliini) mõju (p)ppGpp ja teiste nukleotiidide tasemetele bakterirakus uuriti nii Gram-negatiivsetes kui ka Gram-positiivsetes bakterites, esindajateks vastavalt E.coli ja Bacillus subtilis. (p)ppGpp kuhjumise indutseerimiseks kasutati eeltöötlust muprirotsiiniga. Seejärel lisati uuritav antibiootikum subinhibeerivas kontsentratsioonis. Mõlema bakteriliigi korral pidurdasid kõik testitud translatsiooni inhibiitorid (p)ppGpp kuhjumist. Meie uurimisrühma bioinformaatiline analüüs tuvastas, et mõnedes bakteriliikides on RSH ensüümid, millel on ainult (p)ppGpp sünteesi eest vastutav osa. Leiti, et selline ensüüm bakteris Cellulomonas marina võib fosforüleerida ka adenosiini, tekitades molekuli ppApp. Koos paralleelselt ilmunud töödega teistest laboritest on alust arvata, et tegemist on uudse regulaatornukleotiidiga. Selle nukleotiidi täpse rolli kindlakstegemine nõuab edasisi uuringuid.
RelA-SpoT Homolog toxins pyrophosphorylate the CCA end of tRNA to inhibit protein synthesis
(Cell Press, 2021-08) Brodiazhenko, Tetiana; Alves Oliveira, Sofia Raquel; Roghanian, Mohammad; Sakaguchi, Yuriko; Turnbull, Kathryn Jane; Bulvas, Ondrej; Takada, Hiraku; Tamman, Hedvig; Ainelo, Andres; Pohl, Radek; Rejman, Dominik; Tenson, Tanel; Suzuki, Tsutomu; Garcia-Pino, Abel; Atkinson, Gemma C; Haurilyiuk, Vasili; Kurata, Tatsuki
RelA-SpoT Homolog (RSH) enzymes control bacterial physiology through synthesis and degradation of the nucleotide alarmone (p)ppGpp. We recently discovered multiple families of small alarmone synthetase (SAS) RSH acting as toxins of toxin-antitoxin (TA) modules, with the FaRel subfamily of toxSAS abrogating bacterial growth by producing an analog of (p)ppGpp, (pp)pApp. Here we probe the mechanism of growth arrest used by four experimentally unexplored subfamilies of toxSAS: FaRel2, PhRel, PhRel2, and CapRel. Surprisingly, all these toxins specifically inhibit protein synthesis. To do so, they transfer a pyrophosphate moiety from ATP to the tRNA 3′ CCA. The modification inhibits both tRNA aminoacylation and the sensing of cellular amino acid starvation by the ribosome-associated RSH RelA. Conversely, we show that some small alarmone hydrolase (SAH) RSH enzymes can reverse the pyrophosphorylation of tRNA to counter the growth inhibition by toxSAS. Collectively, we establish RSHs as RNA-modifying enzymes.
Role of the stringent response in antibiotic tolerance of Escherichia coli
(Tartu Ülikool, 2016) Alves Oliveira, Sofia Raquel; Hauryliuk, Vasili; Varik, Vallo; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
The stringent response is a near-universal bacterial adaptation system control mediated by accumulation of two guanine nucleotides ppGpp and pppGpp, collectively known as (p)ppGpp. The response monitors several environmental stress inputs, such as nutrient limitation and heat shock and remodels bacterial physiology in order to overcome the challenges. In Echerichia coli (p)ppGpp levels controlled by two enzymes – RelA and SpoT, the namesakes of RelA SpoT Homologue (RSH) protein family. The stringent response is associated to induction of virulence, antibiotic resistance and was recently suggested to be the driving force behind the formation of so-called persister cells – antibiotictolerant phenotypic variants in antibiotic-sensitive population. Since drug resistance and tolerance constitute a significant public health threat, understanding the connection amongst (p)ppGpp, antibiotic treatment and persistence is of great importance.