Browsing by Author "Reinsalu, Olavi"

Now showing 1 - 3 of 3

A dual colour FISH method for routine validation of sexed Bos taurus semen
(BMC Veterinary Research, 2019) Reinsalu, Olavi; Mikelsaar, Ruth; Mikelsaar, Aavo-Valdur; Hallap, Triin; Jaakma, Ülle; Padrik, Peeter; Kavak, Ants; Salumets, Andres; Kurg, Ants
Background Usage of sexed semen that allows to choose the gender of the calves, is commonly practiced in livestock industry as a profitable breeding alternative, especially in dairy farming. The flow cytometric cell sorting is the only commercially available method for bovine sperm sexing. For validation of the sexing procedure several methods have been developed including sperm fluorescence in situ hybridisation techniques. Latter usually include the use of pre-labelled nucleotides for probe synthesis which is relatively expensive approach compared to combined application of aminoallyl-dUTP and chemical binding of fluorescent dyes. Here a sex determining dual colour bovine sperm fluorescence in situ hybridisation method is presented which is considered more cost-effective technique than the previously reported approaches. Results The reliability of sex chromosome identifying probes, designed in silico, was proven on bovine metaphase plate chromosomes and through comparison with a commercially available standard method. In the dual colour FISH experiments of unsexed and sexed bovine sperm samples the hybridisation efficiency was at least 98%, whereas the determined sex ratios were not statistically different from the expected. Very few cells carried both of the sex chromosome-specific signals (less than 0.2%). Conclusions A protocol for a dual colour bovine sperm FISH method is provided which is cost-effective, simple and fast for sex determination of spermatozoa in bull semen samples.
Cancer-testis antigen MAGE-A4 is incorporated into extracellular vesicles and is exposed to the surface
(2022-06-29) Reinsalu, Olavi; Kurg, Reet, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Vähkkasvaja on väga kompleksne haigus, mis on endiselt üks suurimaid surma põhjusi maailmas. Seetõttu on vähi-uuringud olnud prioriteetne suund teaduses pikka aega. Vähivastane immuunteraapia on paljulubav uudne tehnoloogia, mis seisneb inimese enda immuunsüsteemi ergutamises vähiga tõhusamalt võitlemiseks. Üheks immuunteraapia eelduseks on sihtmärgi ehk antigeenide olemasolu, mis on spetsiifilised just vähkkoe suhtes. Vähi-testis antigeenid (ingl lüh CTA) on valgud, mida tavapäraselt rakud toodavad ehk ekspresseerivad peamiselt munandites ehk testistes, kuid haiguslikult võivad need olla kõrgel tasemel ekspresseeritud ka erinevates vähkkasvajates. On näidatud, et CTA-d osalevad vähi arengut soodustavates protsessides, kuid antigeenidena võivad need esile kutsuda ka vähivastast immuunvastust. MAGE-A4, kui tuntud CTA, on tsütoplasmas või rakutuumas lokaliseeruv osalise korrapäratu struktuuriga valk, millel on kirjeldatud nii vähi kasvu soodustavaid kui ka pärssivaid omadusi. MAGE-A4 täpsest rakulisest funktsioonist on endiselt vähe teada. Üks moodus, kuidas vähk oma arengut ning levikut kehas toetab on rakuväliste ehk ekstratsellulaarsete vesiikulite (EV-d) rakendamine soodsate tingimuste tekitamiseks kehas. EV-d on membraaniga ümbritsetud nanoskaalas osakesed, mida rakud vabastavad endast rakuvälisesse ruumi. EV-sid võib leida kõigist kehavedelikest nagu näiteks verest või uriinist. EV-sid peetakse rakuvahelise suhtluse vahendajateks, sest need on võimelised edastama bioaktiivseid molekule ühest rakust teise. Sellise laia rolli tõttu osalevad EV-d pea kõikides füsioloogilistes ja patoloogilistes protsessides kehas, sh ka vähis. Viiruslaadsed partiklid (VLP-d) on EV-de sarnase struktuuri ja suurusega osakesed, mis erinevad ainult viiruse kapsiidi poolest, mis paikneb vesiikuli sees. VLP-d viiruse genoomi ei sisalda ja pole seetõttu nakkusohtlikud. VLP-de moodustumist on võimalik esile kutsuda kui viia rakkudesse viiruse kapsiidi valgu geen. Tänu biosobivusele ja -stabiilsusele peetakse EV-sid ja VLP-sid potentsiaalseteks vahenditeks uudsetes vähivastastes teraapia ja diagnostika tehnoloogiates. Käesolevas lõputöös avastati, et MAGE-A4 paigutatakse Moloney hiire leukeemia viiruse VLP-desse ja natiivsetesse EV-desse rakkude poolt, mis MAGE-A4 ekspresseerivad. Nii kunstlikult indutseeritud VLP-d kui ka natiivselt moodustunud EV-d eksponeerivad MAGE-A4 nende välispinnal, mis on üllatav nähtus kui arvestada MAGE-A4 rakusisest lokalisatsiooni. MAGE-A4 oli tuvastatav erinevate suurustega EV populatsioonidest, mis viitab MAGE-A4 inkorporeerimisele EV-desse erinevatest alatüüpidest. Tüüpilistes EV-de hoiustamistingimustes olid MAGE-A4 kandvad EV-d (MAGEA4-EV-d) väga stabiilsed – 21 päeva pikkuse mõõtmisperioodi jooksul ei tuvastatud MAGE-A4 kontsentratsioonis ega EV omadustes muutusi. Kuid enam kui kaks sulatus-külmutustsüklit avaldavad MAGEA4-EV-dele kahjulikku mõju, millele viitas tuvastatud MAGE-A4 kontsentratsiooni langus. MAGEA4-EV-de keemiliste töötluste tulemused vihjasid MAGE-A4 seondumisele EV-de membraanile pigem hüdrofoobsete interaktsioonide toel, mitte aga elektrostaatiliste jõudude abil. Puhastatud MAGE-A4 valku ja EV-sid kokku segades järeldati, et MAGE-A4-l on biokeemilisi omadusi, mis võimaldavad sellel seonduda vesiikulite välismembraanile rakulisi mehhanisme kasutamata. MAGE-A4 ekspresseeriti ka liitvalguna rohelise fluorestsentse valguga EGFP-ga hiire fibroblastides, millest eraldati EV-d. Nende analüüsimisel selgus, et MAGE-A4 on võimeline suunama EV-desse täiendavat bioloogilist materjali, mis tavaliselt sinna ei pakita. Liitvalguna ekspresseerimine ei takistanud MAGE-A4 eksponeerumast ka EV-de pinnal nii rakust eraldatuna kui ka passiivse kontakti võimaldamisel. Nende tulemuste põhjal järeldati, et MAGE-A4 võib olla inkorporeeritud EV-desse ja VLP-desse ning paigutatud nende pinnale nii sihipäraste rakuliste radade kui ka MAGE-A4 biokeemiliste omaduste tõttu. Töös kirjeldatud omadused teevad MAGE-A4-st atraktiivse sihtmärgi EV-põhistes uudsetes vähivastastes teraapiates ning mitte-invasiivses diagnostikas.
Melanoomi antigeenidega rikastatud viirus-laadsete partiklite iseloomustamine
(Tartu Ülikool, 2015) Reinsalu, Olavi; Kurg, Reet, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja tehnoloogiateaduskond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut