Browsing by Author "Tenson, Tanel, juhendaja"

Now showing 1 - 17 of 17

Antibodies targeting glucose transporter GLUT1 developed through the methods of Phage Display
(Tartu Ülikool, 2024) Planken, Jaan Eerik; Teyra, Joan, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Tehnoloogiainstituut
Cancer immunotherapy has emerged as a major treatment approach to combat malignant cells. Among the potential targets, the glucose transporter 1 (GLUT1) stands out due to its role in facilitating the increased glucose uptake characteristic of cancer cells. In this thesis, we use the methods of phage display technology to isolate GLUT1-specific antibodies from a diverse phage library constructed from a previously immunized chickens spleen cells. Through four rounds of panning against a GLUT1-overexpressing virus-like particle (VLP), with each round increasing in stringency, we were able to identify 27 unique antibody sequences. All obtained unique antibodies show great specificity towards the GLUT1 VLP, with signals averaging 11 times higher, on an ELISA based binding assay, in comparison to an off-target antigen control.
Characterization of stringent response inhibitors: Thiostrepton and ppGpp analogues
(Tartu Ülikool, 2013) Beljantseva, Jelena; Hauryliuk, Vasili, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja tehnoloogiateaduskond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Design and characterization of antibacterial electrospun drug delivery systems for wound infections
(2022-01-17) Preem, Liis; Kogermann, Karin, juhendaja; Meos, Andres, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Meditsiiniteaduste valdkond
Halvasti paranevad haavad on kaasaegses ühiskonnas kiiresti kasvav sotsiaalmajanduslik probleem. Haavapatoloogiate kujunemises mängivad rolli mitmed faktorid, kuid järjest suuremat tähtsust selles omistatakse biofilmile ja mikrobioloogilise tasakaalu häirumisele haavakeskkonnas. Kaasaegsed haavakatted, kuhu on võimalik viia antimikroobseid raviaineid (RA) ning kontrollida nende vabanemiskineetikat, saavutamaks lokaalseid kliiniliselt olulisi RA kontsentratsioone pikema aja vältel, võivad oluliselt parandada ravikvaliteeti. Elektrospinnimine (ES) on lihtne ja paindlik meetod polümeersete nano- ja mikrofiibermaatriksite valmistamiseks, võimaldades lisada erinevaid RA-sid ning kontrollida nende vabanemist. Lisaks on fiibermaatriksitel mitmeid struktuurseid omadusi, mis teevad neist perspektiivikad haavakattematerjalid. Siiski on endiselt palju teadmata erinevate disainiaspektide mõjust ES-tud fiibermaatriksite funktsionaalsusele ja kvaliteedile. Käesolevas töös valmistati ES teel erinevate omadustega nano- ja mikrofiibermaatrikseid, kasutades erinevaid kandjapolümeere ja antibakteriaalseid RA-sid. ES mõjutas RA tahket vormi ning polümeeride kristallilisust, samuti kutsus esile interaktsioone erinevate maatriksi komponentide vahel. Erinevad fiibermaatriksid vabastasid RA-d erinevalt, kusjuures üheks olulisemaks, aga mitte universaalseks, faktoriks osutus nende märgumine ja puhverlahuse tungimine maatriksisse. Uudsed hüdrogeelidel põhinevad analüüsimeetodid RA vabanemise ja difusiooni hindamiseks jäljendasid võrreldes puhverlahustega paremini in vitro antibakteriaalse aktiivsuse testimise ja arvatavasti ka haavakeskkonna tingimusi. Difusioonitesti abil agarsöötmes sai hinnata vabanenud RAde efektiivsust erinevate mikroorganismide suhtes. Uudsete meetoditega sai lisaks tuvastada erinevusi erineva RA vabanemisprofiiliga maatriksite antibakteriaalses aktiivsuses. Selgus, et aeglane RA vabanemine aitab takistada fiibermaatriksile biofilmi moodustumist, ning et ilma RA-ta haavakate võib olla soodne pind biofilmi tekkeks. Fiibermaatrikseid oli võimalik erinevatel viisidel efektiivselt steriliseerida, kuid see protsess võis muuta maatriksi omadusi sõltuvalt konkreetsest steriliseerimismeetodist ja maatriksi materjalidest.
Development of novel antibacterial drug delivery systems as wound scaffolds using electrospinning technology
(2022-11-16) Lanno, Georg-Marten; Kogermann, Karin, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja; Putrinš, Marta, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Tõusvate kulude ning aina keerulisemate ravijuhtude tõttu on halvasti paranevad kroonilised haavandid muutunud kaasaegses ühiskonnas väga suureks probleemiks. Haavadega kaasneb alati infektsioonioht, seetõttu näeb kaasaegne haavaravi ette, et taastatakse haava homeöstaas ning hoitakse kontrolli all bakterite arvukus. Kõige probleemsemaks osutuvad kaasuvate haigustega patsientidid (näiteks diabeedihaiged), kelle häirunud immuunvastus võib takistada ravi efektiivsust ning pikendada ravi kestvust. Infektsioosse haavandi raviskeemis on antibiootikumide manustamine väga olulisel kohal. Lokaalne antibakteriaalne haavaravi (kasutades enamlevinud traditsioonilisi ravimvorme) on väga levinud, kuid selle efektiivsus on siiani küsitav ravimi lühikese toimeaja ja pideva manustamise tõttu. Seetõttu on kaasaegne ravimvormide teadustöö keskendunud just kohaspetsiifiliste lokaalsete antibakteriaalsete ravimkandursüsteemide väljatöötamisele, mis omaksid veel täiendavat funktsionaalsust (haava paranemise toetamine). Elektrospinnimine (ES) on lihtne ja laialtlevinud meetod polümeersete fiibermaatriksite tootmiseks, millele iseloomulikeks omadusteks on: kontrollitav morfoloogia, suur eripind ning poorsus. Lisaks on maatriksitesse võimalik lihtsa vaevaga inkorporeerida erinevaid raviaineid, mis võimaldab neid kasutada ravimkandursüsteemidena. ES fiibermaatriksid sobivad ideaalselt haavakateteks: omades nahale omase rakuvälise maatriksiga sarnast struktuuri, mis annab neile hea haavaeksüdaadi absorbeerimise võime ning tagab gaasi – ja ainevahetuse haavas. Maatriksite mehaanilised omadused on muudetavad vastavalt vajadusele – lihtsustamaks kasutust ning tagamaks soodsat keskkonda rakkudele, mis vastutavad haavade paranemise eest. Antibakteriaalsete haavakatete väljatöötamisel on oluline uurida nende mõju bakterirakkudele. Haavakate peaks inhibeerima bakterite arvukuse tõusu haavas ning kaitsma haava kontaminatsiooni eest. Käesolevas töös valmistati ES teel antibakteriaalsete omadustega fiibermaatrikseid, mida saaks kasutada lokaalseks haavaraviks. Leiti, et poorseid fiibreid sisaldavate maatriksite valmistamiseks oli oluline sobivate lahustite ning keskkonnaparameetrite valik. Maisivalgul baseeruvate fiibermaatriksite valmistamiseks osutus sobivaimaks koaksiaalse ES ning abiainete kasutamine. Kasutatud lahustid ja abiained mõjutasid fiibermaatriksite morfoloogiat, struktuuri, mehhaanilisi omadusi ning raviaine vabanemise kiirust. Maatriksite ehitus mõjutas oluliselt elusrakkude (bakteri- ning eükarüootsete rakkude) käitumist maatriksitel. Leiti, et poorseid fiibreid sisaldav maatriks soodustas fibroblastide kinnitumist ning kasvu, ja omas ka kõige suuremat E. coli biokile vastast toimet. Maisivalgul baseeruvatel fiibermaatriksitel oli fibroblastide kasv ning kinnitumine väiksem võrreldes polükaprolaktooni sisaldava fiibermaatriksiga.
In search for the inhibitors of Escherichia coli stringent response factor RelA
(2017-09-27) Kudrin, Pavel; Tenson, Tanel, juhendaja; Hauryliuk, Vasili, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Keskkonnatingimuste jälgimiseks ja muutustega kohanemiseks on bakteritel mitmeid sensoorseid süsteeme. Seejuures on levinud strateegiaks sekundaarsete signaalmolekulite kasutamine: stressisignaali ilmumisega muutub signaalmolekulide rakusisene kontsentratsioon ning see omakorda reguleerib sihtensüümide aktiivsust. Üks sellistest stressivastuse süsteemidest on poomisvastus (stringent response), mis aktiveeritakse sõltuvalt alarmoonmolekuli (p)ppGpp rakusisesest kontsentratsioonist. (p)ppGpp on võimeline reguleerima mitmete ensüümide aktiivsust, kuid peamiseks märklauaks on RNA polümeraas. (p)ppGpp rakusisest taset kontrollivad E. coli RelA-SpoT-ga homoloogsed valgud (RSH), mis kas sünteesivad või hüdrolüüsivad (p)ppGpp-d vastavalt keskkonnatingimustele. Eksperimentaalselt on tõestatud, et poomisvastus kontrollib bakterite virulentsust, persisterite moodustamist, antibiootikumide taluvust ning antibiootikumide tootmist, samuti osaleb bakterite hulgatunnetuses (quorum sensing) ja bakterite ellujäämises fagotsütoosi jooksul. Seepärast on poomisvastuse mehhanismide mõistmine väga oluline ja (p)ppGpp rakusisest taset kontrollivate ühendite loomine võiks viia meditsiini ja biotehnoloogia seisukohalt oluliste rakendusteni. Hiljuti avastati, et ppGpp struktuuril põhinev aine Relacin on võimeline inhibeerima RelA aktiivsust kuid tõhusa inhibeerimise jaoks on vaja Relacini kasutada väga kõrges kontsentratsioonis. Käesoleva töö raames iseloomustasin (p)ppGpp struktuuri põhjal disainitud uudsete keemiliste ainete efekti E. coli RelA aktiivsusele. Samuti pakun välja uusi võimalusi RelA inhibiitorite arendamiseks. Peale uute sünteesitud ainete efektide vaatasin üle võimalusi mõjutada poomisvastust juba tuntud translatsiooni inhibiitorite abil ning iseloomustasin thiostreptooni tugevat inhibeerimisvõimet (p)ppGpp sünteesile
In vitro methods for studying the mechanisms of ribosome-targeting antibiotics
(2024-04-22) Hinnu, Mariliis; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Ribosoomis toimuv valkude biosüntees ehk translatsioon on eluks hädavajalik protsess, mistõttu on bakteri ribosoom ka üks peamisi antibakteriaalsete ainete sihtmärke. Antibiootikumresistentsuse kiire leviku tõttu on oluline tõhustada olemasolevaid ja töötada välja uusi raviaineid, ravimvorme ja raviskeeme. Enne kliinilisi katseid inimestel on aga aineid vajalik põhjalikult n.ö. katseklaasis (in vitro) kui ka nakkusmudelites (loomarakud/-koed/elusloomad) uurida. Klassikalistes in vitro meetodites kasutatav keskkond ei sarnane aga alati nakkusaegse peremeesorganismiga. Antud uurimistöö eesmärk oligi vaja välja töötada in vitro meetodeid, mis võimaldaksid uurida antibiootikume inimesega bioloogiliselt sarnases keskkonnas. Fookuses olid ribosoomiga seonduvad antibiootikumid. Antud doktoritöös töötati välja meetodid, mis i) võimaldavad mõõta antibiootikumi vabanemist lokaalseks haavaraviks ette nähtud nanofiibritest; ii) selgitavad, kas verepuhvri olulise koostisosa, bikarbonaadi lisamine katsekeskkonda muudab in vitro antibiootikumtundlikkustestid kliiniliselt täpsemaks, ja iii) võimaldavad mõõta antibiootikumide mõju bakterite translatsiooni täpsusele. Kui testitud nanofiibrid näitasid suuri erinevusi antibiootikumi vabanemises vesikeskkonnas, siis väljatöötatud meetodid pooltahkes keskkonnas näitasid, et erinevused olid tegelikult väga väikesed. Bikarbonaadi katsed näitasid selgelt, et antibiootikumi toimet bakterile mõjutas bikarbonaadi ebapiisavast puhverdamisest tingitud pH-muutus. Töötati välja fluorestseeruvad translatsioonivigade reporterid, mis andsid uut teavet bakterite translatsiooni täpsuse kohta erinevates tüvedes, kasvukeskkondades, k.a. rakusisese nakkuse mudelites, ja antibiootikumide toimel. Kokkuvõttes võimaldavad antud doktoritöös välja töötatud meetodid ribosoomiga seonduvaid antibiootikume paremini uurida.
Makroliidide interaktsioonid ribosoomi tunnelis kasvava peptiidiga
(Tartu Ülikool, 2013) Noorväli, Telin; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja tehnoloogiateaduskond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Nukleotiidide, koodonite ja aminohapete sagedused kõrge ekspressioonitasemega geenides
(2006) Tats, Age; Remm, Maido, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja
Physiological heterogeneity of uropathogenic Escherichia coli in bladder epithelial cell infection model
(Tartu Ülikool, 2023) Hasanov, Turgay; Putrinš, Marta, juhendaja; Kerkez, Ivana, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Tehnoloogiainstituut
Uropathogenic Escherichia coli (UPEC), which invades host cells, is the primary agent of urinary tract infections. Antibiotics are commonly used to treat UTIs. During the long treatment period, bacteria are getting resistant to antibiotics. To increase understanding of antibiotic treatment efficiency of urinary tract infections an in vitro model of intracellular and extracellular infections was needed. Within these, an infection model with HTB-9 human bladder cells and UPEC CFT073 strain has been established. Specific experiments were designed to compare the different conditions to see what the ideal way would be to get the infection to a level where we can use the model to follow infection and antibiotic treatment. To test the viability of the cell, we have compared the CFU results with flow cytometry-based cell counting. The data suggests that bacteria that specifically attach to bladder epithelial cells are targeted by host antimicrobial peptides.
Preparation and assessment of antimicrobial electrospun matrices for prospective applications in wound healing
(2024-04-10) Pozo Ramos, Celia Teresa; Kogermann, Karin, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja; Laidmäe, Ivo, juhendaja; Putrinš, Marta, juhendaja; Tartu Ülikool. Meditsiiniteaduste valdkond
Halvasti paranevad haavad on oluline koorem nii patsientidele kui ka tervishoiusüsteemidele. Tõhus haavahooldus on vajalik nakkuste ärahoidmiseks, mis võivad tekkida kui nahabarjäär on kahjustatud. Tavaliste paiksete ravimpreparaatide probleemiks on lühike toimeaeg haavas ning vähenenud efektiivsus liigse haavavedeliku juuresolekul, samas kui süsteemsed antibiootikumid võivad põhjustada toksilisust. Lisaks põhjustab antimikroobne resistentsus haavanakkuse ravi jaoks suuri väljakutseid ning vähendab võimalust leida sobivat ja toimivat ravimit. Käesolevas doktoritöös arendati uudseid ravimkandursüsteeme, mis võimaldaksid suurendada antimikroobsete ainete efektiivsust. Nano- kuni mikrokiulised elektrospinnitud haavakatted võimaldavad edukalt seondada raviaineid ja seeläbi parandada nende raviainete stabiilsust ning kontrollida vabanemist.. Lisaks sellele suurendavad elektrospinnitud maatriksid, mille morfoloogia ja füsiko-keemilised omadused sarnanevad loodusliku rakuvaheaine omadustega, niiskuse tasakaalu, imendumist ja gaasivahetust haavas, soodustades seeläbi haavade paranemist. Doktoritöö eesmärgiks oli valmistada ja iseloomustada antimikroobseid elektrospinnitud haavakatetena kasutamiseks mõeldud maatrikseid. Raviained klooramfenikool ja pleurotsidiin viidi elektrospinnitud maatriksitesse kasutades erinevaid polümeere, lahustisüsteeme ja elektrospinnimisetehnikaid. Esmalt võeti eesmärgiks valmistada poorseid kiudusid sisaldavad maatriksid. Näidati, et nende poorsete kiudude saamiseks on vajalik kasutada kõrget õhuniiskust ja sobivat lahustit. Elektrospinnitud maatriksite morfoloogiat ja mehaanilisi omadusi analüüsiti ja selgitati välja polümeeri kontsentratsiooni, kiu poorsuse ja lahustisüsteemide mõju maatriksi omadustele ja käitumisele. Elektrospinnimise protsess mõjutas nii raviaine kui ka polümeeri tahke faasi omadusi, põhjustades erinevaid faaside üleminekuid ja raviaine vabanemiskäitumist. Maatriksite hüdrofiilsus/hüdrofoobsus mõjutas raviaine vabanemiskineetikat, samas kui maatriksi morfoloogia mõjutas märgumist ja puhvri penetratsiooni. Maatriksite ohutust ja biosobivust tõestati MTS-testi ja konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia abil. Antibakteriaalsed ja biofilmivastased omadused multiresistentsete haavapatogeenide vastu varieerusid vastavalt maatriksite erinevale morfoloogiale ja raviaine vabanemiskäitumisele. Selgus, et pleurotsidiini sisaldavate maatriksite antibakteriaalsed omadused ületasid tunduvalt värskelt valmistatud pleurotsidiini lahuse antibakteriaalseid omadusi. Lisaks näitas pleurotsidiini kombineerimine erinevate biotsiididega olulisi ja erinevaid koostoimeid. Viimaseid on vaja arvestada pleurotsidiini ja biotsiidide ravi samaaegsel kasutamisel.
Random walks in the stringent response
(2016-11-02) Tankov, Stoyan; Tenson, Tanel, juhendaja; Hauryliuk, Vasili, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond.
Poomisvastus on võtmetähtsusega adaptiivsete mehhanismide regulatsioonil, mis aitavad bakteritel ebasoodsaid keskkonnatingimusi üle elada. Soolekepikeses (Escherichia coli) on selles protsessis oluliseks ensüümiks RelA, mis vastusena aminohappenäljale sünteesib signaalmolekuli (p)ppGpp. See signaalmolekul mõjutab transkriptsiooni, translatsiooni ja rakkude jagunemist. Meie töötasime välja ühe molekuli jälgimise mikroskoopia metoodika, mis võimaldab mõõta molekulide difusiooni rakus. Kasutasime seda metoodikat erineva kiirusega liikuvate molekulide kirjeldamiseks. Rakus vabalt difundeeruva valgu näiteks oli fluorestseeruv valk mEos2. Hoopis teistsuguste omadustega valguks osutus mitokondri membraanivalk Tom40, mille liikumine on ühte asukohta piiratud. RelA puhul täheldasime nii vabu, kiirelt difundeeruvaid molekule kui ka ribosoomile seondunud ja seetõttu aeglaselt liikuvaid molekule. Kombineerides ühe molekuli jälgimise tulemusi biokeemiliste andmetega, pakume välja RelA valgu töötsükli mudeli. Kuhjuv (p)ppGpp põhjustab samuti RelA aktivatsiooni. Sellisel viisil tekib positiivse tagasisidestusega regulatsioonisüsteem ja signaalmolekuli kontsentratsioon tõuseb kiiresti.
RelA-SpoT homolog enzymes as effectors of Toxin-Antitoxin systems
(2022-10-25) Brodiazhenko, Tetiana; Hauryliuk, Vasili, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Nagu kõik elusorganismid, tunnetavad bakterid keskkonda ja reageerivad suurele hulgale erinevatele stressidele, kohandades vastavalt oma füsioloogiat. Üks peamisi stressivastuseid on poomisvastus. Poomisvastus vahendab bakterite kohanemist toitainete vähesusega, samuti vastust abiootilisele keskkonnastressidele nagu näiteks kuumašokk. Rohkem kui kuus aastakümmet tagasi avastati, et häirenukleotiidid ppGpp ja pppGpp – ühiselt viidatud kui (p)ppGpp – ehk maagilised laigud tekivad Escherichia coli rakkudes vastusena aminohapete vähesusele. Poomisvastuse esimene füsioloogiline roll, mis tuvastati, oli stabiilse RNA (rRNA ja tRNA) sünteesi pärssimine, mis on kooskõlastatud aminohapete biosünteesi ja stressitaluvusega seotud geenide ekspressiooni indutseerimisega. Aastakümneid kestnud uuringud on aga näidanud, et lisaks transkriptsioonile on (p)ppGpp sihtmärkideks ka mitmed muud rakus toimuvad protsessid, nagu translatsioon, ribosoomide kokkupanek, antibiootikumiresistentsus ja virulentsus. Veel üks oluline bakterite regulatsioonisüsteem põhineb toksiini – antitoksiin (TA) süsteemidel. Esimesed toksiini-antitoksiin (TA) süsteemide esindajad avastati 80ndate alguses. Klassikalised TA süsteemid on bitsistroonilised – st koosnevad kahest geenist – operonist, milles üks geen kodeerib valgulist toksiini ja teine antitoksiini, valku või RNAd, mis toksiini kas otseselt või kaudselt neutraliseerib. TA-süsteemide uuringud on viimastel aastatel plahvatuslikult kasvanud, avastatud on arvukalt uusi TA perekondi, iseloomustatud nende toimemehhanisme, iseloomustatud bioloogilisi funktsioone ja pakutud välja võimalikke rakendusi biotehnoloogias. Enim iseloomustatud funktsioonid hõlmavad plasmiidi säilitamist, kaitset bakteriofaagide vastu ja rakufüsioloogia reguleerimist. Käesolevas uuringus kirjeldati RSH perekonna ensüümide uusi aktiivsusi ja toksiinide neutraliseerimise spetsiifilisust PanA antitoksiini perekonna liikmete poolt. Lisaks eelpool kirjeldatud protsessidele toimub stressi ajal ribosoomide dimerisatsioon. See stressivastus on kasulik rakkudele ellujäämiseks, kuid võib lüsaatide kasutamise korral biotehnoloogias olla probleemiks kuna vähendab rakuvabade translatsioonisüsteemide aktiivsust. Seetõttu uuriti ribosoomi dimeriseerumise eest vastutavate valkude eemaldamise mõju rakulüsaatide aktiivsusele. Leiti, et RSH ensüümide ensümaatiline aktiivsus ei piirdu (p)ppGpp tootmise ja lagunemisega. ToxSAS RSH PhRel2, FaRel2, PhRel ja CapRel alamperekondade liikmed katalüüsivad tRNA 3'CCA otsa pürofosforüülimist ja FaRel perekonna liikmed katalüüsivad (pp)pApp sünteesi. SAH alamperekonna liikmed MESH1 ja ATfaRel katalüüsivad pürofosfaadi eemaldamist PP-tRNA-st ja (pp)pApp lagunemist. Ühist PanA domeeni sisaldavad antitoksiinid neutraliseerivad erinevaid toksiine. PanA-vahendatud toksiinide neutraliseerimine on toksiini osas siiski spetsiifiline. Ribosoomi dimerisatsioonifaktorite geneetiline elimineerimine bakteri B. subtilis (hfp) ja pärmi S. cerevisiae (stm1) tüvedes on paljulubav strateegia aktiivsemate rakuvabade translatsioonilüsaatide tootmiseks. Reaktsiooni optimeerimisel on oluline panna tähele Mg2+ ja muude komponentide kontsentratsioone ja omavahelisi suhteid.
Ribosome Degradation in Living Bacteria
(2017-05-09) Paier, Anton; Maiväli, Ülo, juhendaja; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Ribosoomid on makromolekulaarsed kompleksid, mis koosnevad kahest suurest ja ühest väikesest RNAst ja paljudest erinevatest valkudest. Ribosoomides sünteesitakse kõik valgud, mida organismis leida võib, ning aktiivsete ribsoomide konsentratsioon (ja seega sünteesi kiirus) limiteerib rakkude kasvu kiirust. Ehk teisisõnu, mida kiiremini sünteesitakse uusi ribosoome, seda kiiremini kasvab ja jaguneb ka rakk. Kuna ribosomaalse RNA süntees hõlmab ca 80% raku RNA sünteesi aktiivsusest ja ribosoomi valgud moodustavad kuni veerandi raku valgumassist on selge, et mitte ainult ribosoomide funktsioon valgusünteesil vaid ka nende metabolism on rakulises majapidamises määrava tähtsusega. Tõepoolest, juba mõnda aega on teada, et aeglaselt kasvavates bakterirakkudes tegeleb enamus raku RNA lagundamise võimekusest värskelt sünteesitud ribosomaalse RNA lagundamisega. Sellegipoolest on viimase 50 aasta vältel üldiselt usutud, et kord juba valmis tehtud ja kokku pakitud ribosoomid on äärmiselt stabiilsed ning, et neid lagundatakse vaid tugeva stressi tingimustes. Samuti on meie teadmised ribosoomide lagundamise molekulaarsetest mehhanismidest bakteris üsnagi piiratud. Käesoleva doktoritöö eesmärk on kirjeldada ribosoomide lagundamist kasvavates soolekepikese (Escherichia coli) rakkudes ja heita valgust ribsoomide lagundamise mehhanismidele, molekulaarsetele radadele ning ensüümidele, mis selles protsessis osalevad. Me avastasime üllatusega, et kuigi ribosoome tõepoolest lagundatakse kasvavates bakterirakkudes, toimub see protsess vaid rakukultuuri kasvu aeglustumise perioodil, mis eelneb statsionaarse kasvufaasi saabumisele. Meil ei õnnestunud tuvastada küpsete ribosoomide lagundamist ei ühtlase kiirusega kasvavates ega ka null-kiirusega kasvavates rakkudes. Võimalik, et ribosoomide lagundamine aitab rakke neid ette valmistades eluks statsionaarses faasis, mil ei vajata suurt valgusünteesi võimekust, küll aga vabu komponente, millest elutingimuste paranedes kiiresti uusi makromolekule tootma hakata. Lisaks leidsime, et osad (kuid mitte kõik) ribosoomi RNAd inaktiveerivad mutatsioonid viivad samuti ribsoomide lagundamisele, kuid miskipärast lagundatakse siis nii mutantseid ning inaktiivseid kui metsiktüüpi ning aktiivseid ribosoome. Jällegi viitab see, et ribsoomide lagundamise eesmärk võiks olla üldise ribosoomide konsentratsiooni alandamine rakus. Kui me lisasime ribsoomide lagundamise katsesüsteemi valgusünteesi pärssivat antibiootikumi kloramfenikool, päästsime me sellega ribosoomid lagundamisest. Seda tulemust võib tõlgendada viisil, et de novo valgusüntees on vajalik ribosoomide lagundamisprogrammi käivitamiseks rakus. Testides ribosoomide lagundamise võime osas bakteritüvesid, kus puuduvad erinevad RNAd lagundavad ensüümid, leidsime kaks ensüümi, mille puudumise korral ribosoome ei lagundatud. Neist esimene, RNaas R, lõhub RNAsid alates nende tagumisest ehk 3’ otsast ning tunneb erilist lõbu kõrge sekundaarstruktuuriga RNA-de hävitamisest. RNaas R on ka eelnevalt näidatud osalevat ribosoomide lagundamisel. Teine ensüüm on seevastu suhteliselt vähetuntud endoribonukleeas nimega YbeY, mis lõikab RNAd katki keskelt, mitte ei lagunda seda otstest. See huvitav valk on arvatud osalevat ribsoomide kokkupakkimise kvaliteedikontrollil, kus ta on vajalik kõige viimases etapis, mil tuntakse ära valgusünteesil ebaõnnestuvad ribosoomid ja suunatakse need lagundamisse. Meie katsed viitavad, et seesama valk võib valla päästa ka töökorras olevate ribosoomide lagundamise, tehes ribosoomi RNAsse esimese lõike ning tekitades sellega kaitsetu 3’ otsa, mida tunneb ära RNaas R, mis omakorda suudab ribosoomi RNA täielikult lagundada
Ribosome-targeting antibiotics and mechanisms of antibiotic resistance
(2017-04-17) Allas, Ülar; Tenson, Tanel, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Valgusüntees võib olla reguleeritud polüpeptiidahela poolt, mida ribosoom parajasti sünteesib. Teatud peptiidide transleerimine põhjustab ribosoomi seiskumist, mis omakorda takistab allavoolu paiknevate geenide ekspresseerumist. Teatud juhtudel vajatakse seisaku toimumiseks väikese ligandmolekuli (antibiootikum, aminohape vms) juuresolekut. Tuntakse mitmeid ribosoomi seisakut põhjustavaid peptiide, kuid nende võrdlemisel pole leitud ühtset konsensusjärjestust. Samas võib oletada, et reeglite tuvastamine on võimalik, kui analüüsida suuremat hulka peptiide. Seetõttu töötasime välja selektsioonimeetodi ribosoomi peatavate peptiide leidmiseks. Oma meetodit kasutades identifitseerisime järjestused, mis peatasid translatsiooni erütromütsiini, troleandomütsiini, klooramfenikooli, meta-toluaadi või homoseriinlaktooni juuresolekul. Need järjestused olid aktiivsed peptiidi tasemel. Me ei tuvastanud peptiidide aminohappeliste järjestuste võrdlemisel universaalset konsensusjärjestust. Siiski märkasime teatud seaduspärasusi. Näiteks selgus, et erütromütsiini juuresolekul toimuv ribosoomi seiskumine vajab eelistatult hüdrofoobset kasvavat peptiidi. On võimalik, et ribosoomi peatumist põhjustavate järjestusmotiivide leidmiseks tuleb analüüsida suuremat peptiidide valimit. Samuti avastasime, et seisakut põhjustavate peptiidide funktsionaalsus võib olla mõjutatud vastava mRNA omaduste poolt. Meie meetod võib olla rakendatav biotehnoloogias. Teoreetiliselt võiks ribosoomi peatumist põhjustavaid peptiide kasutada selleks, et luua uudseid geeniekspressiooni süsteeme, milles regulatsioon toimub translatsiooni tasemel. Väitekirja teine publikatsioon kirjeldab antibiootikumiresistentsuse mehhanismi, mis toimub ribsoomi kaitsevalkude vahendusel ja tagab resistentsuse tetratsükliinile. Töö aluseks oli ribosoomi ja kaitsevalgu Tet(O) kompleksi atomaarne mudel. Struktuuriuuringud näitasid, et Tet(O) interakteerub nii väikese kui suure ribosoomi alaühikuga. Me tegime asendus- ja deletsioonimutatsioone Tet(O) domään IV lingudesse 465, 438 ja 507, mis mudeli kohaselt interakteeruvad otseselt tetratsükliini seondumiskohaga või asuvad selle lähedal. Mutantsete ja metsik-tüüpi Tet(O) variantide analüüs näitas, et kõik kolm lingu on Tet(O) tööks hädavajalikud. Asendusmutatsioonid lingudes vähendasid Tet(O) aktiivsust ja deletsioonid kaotasid aktiivsuse täielikult. Struktuursete uuringute ja mutatsioonanalüüsi tulemusi kõrvutades pakkusime välja mudeli Tet(O) vahendusel toimuva tetratsükliiniresistentsuse mehhanismi selgitamiseks. Meie arvates muudab Tet(O) ling 465 tetratsükliini seondumiskoha juures 16S rRNA struktuuri. See nõrgendab interaktsiooni tetratsükliini molekuli ja 16S rRNA vahel ning võimaldab lingul 507 ravim ribosoomilt eemale tõugata. Me oletasime, et ling 438 koos 16S rRNA nukleotiididega moodustab kanali, mille kaudu tetratsükliin ribosoomilt lahkub. Väitekirja kolmas publikatsioon puudutab probleeme, mis on seotud uute turule ilmuvate antibiootikumidega. Nende hulgas leidub ravimeid, mille toimemehhanism pole veel täiesti selge. Üheks selliseks näiteks on nitrovinüülfuraanide hulka kuuluv G1 ehk Furvina®. G1 laguneb vees ja tioolrühmi sisaldavate ühendite (näiteks tsüsteiini) olemasolu keskkonnas kiirendab seda protsessi. Tuumamagnetresonantsi ja kõrgefektiivse vedelikukromatograafia meetodeid kasutades selgitasime välja G1 lagunemise reaktsiooniskeemi ja selle käigus tekkivad ühendid. Leidsime, et G1 antibakteriaalne toime põhineb valkudes sisalduvate tioolrühmade modifitseerimisel. On teada, et vähemalt mõned G1 lagunemise käigus tekkivatest ühenditest säilitavad antimikroobse aktiivsuse. Selleks, et teha vahet G1 ja selle laguproduktide põhjustatud antimikroobsetel efektidel, inkubeerisime uuritavat ainet enne antimikroobse aktiivsuse mõõtmist erinevates vedelsöötmetes. Selgus, et tsüsteiinivabas söötmes on G1 antimikroobne võimekus suurem kui tioolrühmi sisaldavas söötmes. Samas jäid antimikroobsed omadused alles isegi pärast kahe tunni pikkust testile eelnenud inkubatsiooniaega. Me järeldame, et G1 aktiivsus on aine kohese reaktiivsuse ja laguproduktide antimikroobsete aktiivsuste summa. Tulemused näitavad, et G1 võib sobida jagunevate bakterirakkude kasvu takistamiseks, kuid ei ole efektiivne vahend mittejagunevate bakterite vastu.
Small fine-tuners of the bacterial stringent response – a glimpse into the working principles of Small Alarmone Synthetases
(2020-07-13) Beljantseva, Jelena; Tenson, Tanel, juhendaja; Hauryliuk, Vasili, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Bakterid elavad pidevalt muutuvates ja tihtipeale karmides tingimustes. Nad asustavad kõige ligipääsmatuid paiku maailmas ja suudavad ellu jääda äärmuslikult külmades või kuumades kohtades, taluvad liigset soolsust või hapnikuvaegust. Samuti ka patogeensete bakterite jaoks on peremeesorganismi immuunsüsteem väljakutse millele vastu panna. Selleks, et kiiresti reageerida ja edukalt toime tulla muutlike ja ebasoodsate oludega on bakterirakkudel evolutsioneerunud spetsiaalsed keerukad regulatoorsed mehhanismid. Üheks kõige levinumaks selliseks mehhanismiks on “bakteriaalne poomisvastus”. Poomisvastus on vahendatud alarmoonmolekuli (p)ppGpp poolt, mida sünteesitakse vastuseks aminohappevaegusele ja muudele stressitingimustele. Selle akumuleerumine rakus soodustab bakterite ellujäämist mõjutades erinevaid rakulisi protsesse nagu transkriptisoon, translatsioon, replikatsioon. (p)ppGpp mängib olulist rolli ka bakterite virulentsuses, biofilmi tekkes ja ka antibiootikumresistentsuses. Seega poomisvastuse uurimine on ka kliinilisest aspektist väga oluline. (p)ppGpp molekuli tase rakus on reguleeritud bakterites konserveerunud RelA-SpoT homoloogsete (RSH) valkude poolt. Käesolev käsikiri on pühendatud RSH valguperekonna vähemtuntud liikmete uurimisele – E. faecalis RelQ ja S. aureus RelP. Nimelt uurisin nende valkude ensümaatilisi omadusi ja tõepoolest leidsin, et need omavad erilisi tunnuseid võrreldes teiste uuritud RSH valkudega. Erinevused nende valkude funktsioonides rõhutavad nende rolli poomisvastuse häälestamises ja seeläbi viitavad bakterite mitmekülgsele võimele reguleerida oma elutegevust erinevates tingimustes.
Stringent response in bacterial growth and survival
(2017-09-05) Varik, Vallo; Tenson, Tanel, juhendaja; Hauryliuk, Vasili, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Bakterid peavad ellu jäämiseks pidevalt kohanema oma väliskeskkonnaga. Sobivates tingimustes kasvavad paljud bakteriliigid väga kiiresti. Kiire kasv iseenesest viib aga kasvutingimuste muutumiseni. Nüüd kohtame järgmist bakteritele iseloomulikku omadust — jaksu pikka aega elus püsida kasvuks mittesobivates tingimustes. Seejuures säilitavad nad olulise võime kiiresti taas kasvama hakata, kui keskkonnatingimused paranevad. Muutuvate keskkonnatingimustega kohanemiseks on bakteritel evolutsiooni käigus välja kujunenud hulganisti mehhanisme. Üks selline, keskne ja pea kõigis bakterites esinev mehhanism on poomisvastus. Poomisvastust kutsuvad esile järsud muutused keskkonnas, mis nõuavad kasvu aeglustumist, sageli peatub kasv esialgu täielikult, rakk kohaneb ja kui võimalik, jätkab kasvamist muutunud tingimustes paraja tempoga. Vähemaks reguleeritakse näiteks valgusünteesi masinavärk ning rohkemaks elus püsimise ja autonoomsuse tarbeks oluline — hulganisti kahjustuste eest kaitsevaid süsteeme ja tarvilikud anaboolsed protsessid. Poomisvastust orkestreerivad signaalmolekulid, guanosiin nukleotiidid pppGpp ja ppGpp, koondnimega (p)ppGpp. Nende nukleotiidide sünteesi eest vastutavad Escherichia coli-s kaks valku, RelA ja SpoT. Viimane neist hoolitseb ka selle eest, et (p)ppGpp-d oleks rakus parasjagu, s.t SpoT on kahefunktsionaalne, omab ka (p)ppGpp-d lagundavat aktiivsust. Mitmetes teistes bakterites (näiteks Bacillus subtilis) on poomisvastuse tarbeks vaid üks peamine kahefunktsionaalne ensüüm (RelBsu), aga ka hiljuti avastatud väikesed valgud, millest on veel vähe teada ja mis omavad kas sünteesi või hüdrolüüsi aktiivsust. Arvestades poomisvastuse ulatuslikku mõju bakteriraku füsioloogiale, ei tule vast üllatusena, et see protsess mõjutab bakterite võimet põhjustada haigust ja antibiootikumide võimet infektsiooni ravida. Antibiootikumide kasutamise algusaegadest peale pandi tähele, et sugugi mitte kõik bakterirakud ei sure baktereid tapva antibiootikumi toimel, üksikud bakterid jäävad ikka elama. Erinevalt antibiootikumi resistentsusest ei kasva sellised rakud antibiootikumi juuresolekul, nad lihtsalt taluvad, elavad üle, ja neid nimetatakse persistoriteks. Ka persistorite moodustumises on nähtud poomisvastuse rolli — kui suurem osa bakteritest kasvab jõudsalt, lülitub üksikutes siiski millegipärast sisse poomisvastus. Oletatakse, et persistorid võivad antibiootikumi kuuri lõppedes põhjustada haiguse taastekkimist. Haigusest jagu saamisel on aga antibiootikumiga võrdväärne roll kanda immuunsüsteemil, mis võiks ju jagu saada sellistest mittejagunevatest persistoritest. Samas on vähe teada selliste persistor-rakkude ja immuunsüsteemi vahelistest seostest, mida asutigi käesolevas töös kõigepealt uurima. Selgus, et nn kaasasündinud immuunsüsteem inimese vere seerumi komplemendi näol ei tapa sugugi kõiki uropatogeense E. coli rakke. Kui nüüd samaaegselt seerumile rakendati ka antibiootikumi töötlust, sõltus tulemus konkreetsest antibiootikumist. Ampitsilliini (rakukesta sünteesi inhibiitor) või amikatsiini (translatsiooni inhibiitor) lisamisel vähenes seerumis ellujäävate bakterirakkude hulk ühe-kahe suurusjärgu võrra, mis lubab oletada, et mõned rakud, mida seerum ei hävita, tapeti antibiootikumi poolt. Lisaks võimendas seerum amikatsiini toimet subinhibitoorsete kontsentratsioonide puhul. Norfloksatsiini (DNA replikatsiooni inhibiitor) lisamine seerumile ei põhjustanud mingit muutust ellu jäänud bakterirakkude arvukuses, mistõttu võib spekuleerida, et komplement ja norfloksatsiin tapavad ühesuguseid rakke. Uurimaks bakteripopulatsiooni võimaliku heterogeensuse mõju komplemendi süsteemi vahendatud tapmisele, analüüsiti järgmiseks bakterirakkude jagunemist üksikraku tasemel. Katsetulemused näitasid, et kuigi komplement tunneb ära kõik bakterirakud, ja suurem osa bakterirakkudest sureb, jäävad elama keskmisest oluliselt kiiremini kasvavad ja mittekasvavad rakud. Kui nüüd samal ajal rakendada antibiootikumi töötlust (ampitsilliini, amikatsiini või norfloksatsiiniga), jäävad alles vaid mittekasvavad rakud ning kiiremini kasvavad hävitatakse. Kuivõrd katsed seerumiga näitasid muuhulgas, et bakterite suremisel on positiivne korrelatsioon rakkude seerumis kasvama hakkamisega ja mittejagunevad rakud on kaitstud nii antibiootikumi toime kui komplemendi eest, uuriti järgmisena E. coli rakkude kasvama hakkamise regulatsiooni ja poomisvastuse rolli selles. Selgus, et rakud, kus puudub peamine poomisvastuse valk RelA (edaspidi ΔrelA tüvi), hakkavad soodsate kasvutingimuste saabudes kasvama neli tundi hiljem metsiktüüpi rakkudest, kui keskkonnas puuduvad aminohapped. Lisaks aminohapetele mõjutas kasvama hakkamist ka süsinikuallikas — ΔrelA tüvi toibus metsiktüüpi tüvest hiljem süsinikuallikana glükoosi sisaldaval söötmel, ent võrdväärselt glütseroolil kasvades. Selgus, et selline RelA funktsiooni puudumine ja toibumisdefekt võib mõjutada antibiootikumi toimet—ampitsilliin tappis glükoosil toibuvaid metsik-tüüpi rakke efektiivsemalt kui ΔrelA rakke. Mõnevõrra üllatuslikult elasid ΔrelA rakud paremini üle ka ampitsilliinitöötluse glütseroolil toibudes. Igatahes, teatud tingimuste korral võib poomisvastus olla vajalik rakkude kiiresti kasvama hakkamiseks, mis omakorda võib mõjutada antibiootikumi toimet neile rakkudele. Eelpool nägime, et poomisvastusel on roll bakterirakkude kasvama hakkamisel ja see mõjutab antibiootikumi toimet neile rakkudele. Tõsi küll, teatud üsnagi kitsastes tingimustes oli funktsionaalse poomisvastuse puudumine ampitsilliini toime üle elamiseks kasulik. Samas on küllaldaselt töid, mis näitavad, et poomisvastuse puudumise korral on vähenenud bakterite võime haigust põhjustada. Koos antibiootikumi resistentsuse hirmuäratava levikuga otsitakse seepärast ka spetsiifilisi poomisvastuse pärssijaid üsna palavikuliselt. Isegi kui neist ei ole peatset ja vahetut kasu meditsiinile, oleksid spetsiifilised inhibiitorid oluline töövahend bakteriraku füsioloogia uurimiseks. Sestap soovisime järgmiseks leida poomisvastuse inhibiitoreid. Neid otsiti keemiliste ühendite raamatukogust (17500 ühendit), kasutades testsüsteemina bakterit B. subtilis, sest ainete sisenemine rakku on gram-positiivsetel bakteritel hõlpsam kui gram-negatiivsetel. . Otsingu tulemusel leiti 17 uut antibakteriaalset ühendit, kahjuks polnud ükski neist piisavalt spetsiifiline poomisvastuse suhtes. Jääb üle vaid loota, et välja töötatud kõrge läbilaskevõimega poomisvastuse inhibiitorite testsüsteem annab positiivse tulemuse mõne teise keemiliselt sünteesitud ja/või loodusest isoleeritud ühendite raamatukogu puhul.
Translatsiooni moduleerivate geenide roll bakteri antibiootikumitundlikkuses
(2006) Luidalepp, Hannes; Tenson, Tanel, juhendaja; Remme, Jaanus, juhendaja