Browsing by Author "Utt, Age"

Filter results by typing the first few letters
Now showing 1 - 2 of 2
  • Thumbnail Image
    Item
  • Thumbnail Image
    Item
    Role of alphavirus replicase in viral RNA synthesis, virus-induced cytotoxicity and recognition of viral infections in host cells
    (2016-05-24) Utt, Age; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond.
    Alfaviirused on positiivse polaarsusega RNA genoomsed viirused. Alfaviiruste levik selgroogsete peremeeste vahel toimub enamasti lülijalgsete vektorite vahendusel. Alfaviiruste perekonda kuulub ka suure meditsiinilise tähtsusega Chikungunya viirus (CHIKV). CHIKV infektsiooni iseloomustab kõrge palavik, lööve ja lihasevalu, eriti iseloomulik on aga liigesevalu, mis võib muutuda krooniliseks ning kesta kuid või isegi aastaid. Praeguseks hetkeks puudub selle viiruse vastane vaktsiin või spetsiifiline ravim, võimalik on leevendada vaid sümptomeid. Kliima muutused ja ülemaailmne reisimine on võimaldanud CHIKV-l levida ka piirkondadesse, kus teda varem ei ole olnud. Näiteks jõudis CHIKV 2013. aasta lõpus Ameerikasse, kus tema levik on võtnud epideemia mõõtmed. Seetõttu on CHIKV uurimine intensiivistunud, kuid siiski on tema kohta käivad teadmised lünklikud ja ebapiisavad. Selleks, et välja töötada CHIKV vastaseid vaktsiine või ravimeid tuleb esmalt põhjalikult uurida tema molekulaarbioloogiat ja, mis veelgi olulisem, mõista kuidas CHIKV ja tema peremees teineteist vastastikku mõjutavad. Paraku on tegemist ohtliku patogeeniga, mille töötamine on raskendatud kõrgest bioohutuse tasemest tulenevate tingimuste tõttu. Seetõttu on CHIKV uuringuteks eriti vajalikud ohutud ja samas ka efektiivsed tööriistad. Seega antud uurimustöö eesmärgiks saigi selliste tööriistade väljatöötamine, mis hõlbustaksid CHIKV uurimist. Esmalt konstrueerisime mittetsütotoksilised CHIKV replikonid, mis võimaldavad neid sisaldavate rakkude järjepidevat paljunemist. Töö käigus loodi püsiliinid ja tehti kindlaks erinevad mutatsioonide kombinatsioonid nsP2 valgus, mis vähendasid CHIKV replikoni tsütotoksilisust. Iseloomustati ka mutatsioonid nsP1 ja nsP3 valkudes, mis võimaldasid mittetsütotoksilise CHIKV replikoni püsimist inimese rakkudes. Läbiviidud analüüsid näitasid, et mutatsioonid nsP2 valgus mõjutavad selle ensümaatilisi aktiivsuseid ning vähenenud tsütotoksilisusega fenotüübid erinevad molekularsete mehhanismide poolest. Lisaks leiti, et sellised stabiilsed ja markervalke tootvad rakuliinid kujutavad endast efektiivseid ja ohutuid tööriistu, mis võimaldavad CHIKV vastaste inhibiitorite otsimist ja nende toime analüüsimist. Teiseks töötasime välja uudse CHIKV põhise trans-replikaasi süsteemi, kus replikaasi valkude tootmine ja nende poolt läbiviidav RNA paljundamine on teiseteisest lahutatud. Näitasime, et selline süsteem võimaldab uurida erinevate mutatsioonide või mittestruktuursetele valkudele lisatud tagide otseseid efekte replikaasi võimele läbi viia RNA sünteesi. Võrrelduna infektsioonilise viirusega omab CHIKV trans-replikaas sellistes analüüsides selgeid eeliseid, sest viiruse kontekstis põhjustavad paljud mutatsioonid geneetilist ebastabiilsust. Lisaks leidsime, et konstueeritud trans-replikaasi süsteem võimaldab väga edukalt uurida viiruse ja peremeesraku vahelisi interaktsioone. SFV trans-replikaasi kasutades avastasime alfaviiruste replikaasi uue funktsiooni – võime kasutada rakulisi RNAsid sünteesimaks kaasasündinud immuunvastust aktiveerivaid kaheahelalisi RNA molekule. Samas aga selgus huvitav tõsiasi, et CHIKV replikaas ei ole võimeline meie poolt kirjeldatud viisil immuunsüsteemi aktiveerima. Seega leidsime, et kahe väga sarnase alfaviiruse äratundmine peremeesraku poolt toimub väga erineval moel. Käesoleva uurimustöö käigus on loodud rida unikaalseid ja efektiivseid CHIKV molekulaarbioloogia uurimise tööriistu. Nende kasutamine on võimaldanud paremini mõista nii CHIKV molekulaarbioloogiat kui ka alfaviirus - peremees vahelisi interaktsioone.