The Absence of GacA/S signal transduction system af-fects the frequency of base substitution and frameshift mutations in Pseudomonas putida KT2400

Abstract

GacA/GacS two-component system can be found in Gram-negative bacteria, including enteric bacteria and Pseudomonas. gacS gene encodes for a membrane-bound sensor kinase GacS, whereas a transcriptional response regulator GacA is encoded by gacA gene. The aim of this thesis was to investigate whether the inactivation of the GacA/GacS two-component system could affect mutation frequency in Pseudomonas putida. Two test systems were employed for measuring mutation frequency: chromosomal RifR assay and a plasmidial test system based on lactose degradation. RifR phenotype of bacteria is a result of mutations that decrease the affinity of rifampicin binding to the β subunit of RNA polymerase. This makes this enzyme insensitive to rifampicin. The second test system is based on the monitoring mutations in lacZ gene encoding for β-galactosidase, which turns the tester strains from Lac- to Lac+ phenotype. Usage of both test systems revealed that the inactivation of the gacA gene elevates mutation frequency in P. putida. In estonian: GacA/GacS kahekomponendiline süsteem on kirjeldatud erinevates Gram negatiivsetes bakteriliikides, kuhu kuuluvad ka enterobakterid ja erinevad Pseudomonase liigid. Geen gacS kodeerib membraan-seoselist sensorkinaasi GacS ning transkriptsiooni regulaator GacA, mis saab signaali GacS-lt, on kodeeritud geeni gacA poolt. Käesoleva bakalaureusetöö eesmärgiks oli välja selgitada, kas GacA/GacS süsteemi inaktiveerimine mõjutab bakteris Pseudomonas putida mutatsioonisagedust. Mutatsioonisageduse mõõtmiseks kasutati kahte testsüsteemi: kromosomaalset RifR süsteemi ja plasmiidset laktoosi lagundamisel põhinevat Lac+ süsteemi. RifR fenotüübiga bakterites on tekkinud mutatsioonid, mis vähendavad rifampitsiini seondumist RNA polümeraasi β-subühikuga, muutes sel viisil ensüümi rifampitsiini suhtes tundetuks. Teine testsüsteem põhineb β-galaktosidaasi kodeerivas geenis lacZ tekkivate mutatsioonide tuvastamisel, mis võimaldavad Lac- testertüvedel hakata lagundama laktoosi (Lac+ reversioon). Töö tulemustena selgus, et gacA geeni inaktiveerimine bakteris P. putida põhjustas mutatsioonisageduse suurenemist mõlemate testsüsteemide rakendamisel.