Escherichia coli biosensori kasutamine suplusvee kvaliteedi hindamiseks

Abstract

Käesoleva magistritöö eesmärgiks oli biosensori konstrueerimine Escherichia coli määramiseks looduslikus vees ja selle alusel vee mikrobioloogilise saastatuse hindamine Tartu Anne kanali näitel. Biosensoriga saadud tulemusi võrreldi mikrobioogiliste külvide ning qPCR meetodite abil saadud tulemustega, et hinnata eri meetoditel saadud tulemuste kokkulangevust. Töös uuriti ka vees leiduvate kolivormsete bakerirakkude ning osaliselt ja täielikult lagunenud E. coli rakkude poolt põhjustatud efekti biosensori mõõdetavas signaalis. Magistritöö käigus konstrueeriti biosensor ning viidi läbi E. coli analüüsid kasutades konstrueeritud biosensorit, mikrobioloogiliste külvide meetodit ning qPCR-analüüsi. Konstrueeritud biosensori lineaarne tööpiirkond asus vahemikus 101 – 107 CFU/ml ning määramispiiriks oli < 10 CFU/ml PBS-puhvris ning < 30 CFU/ml Anne kanali veeproovides. Ühe analüüsi läbiviimiseks kuluv aeg oli 20 minutit. Kolmel meetodil (mikrobioloogilised külvid, qPCR ja E. coli biosensor) analüüsitud Anne kanali veeproovide tulemustest selgus, et E. coli ja kolivormsete bakterite arvukus oli suurim augustikuu kolmandal nädalal, seevastu kui qPCR meetodiga saadud tulemused näitasid E. coli suurimat kontsentratsiooni ligikaudu kaks nädalat varem. Erinevate meetodite signaalide dünaamika erinevused on seletatavad elusate ja surnud rakkude suhte osakaalu muutumisega veeproovides. Biosensoriga registreeritud kõrgeim E. coli kontsentratsioon veeproovis oli orienteeruvalt 40 korda kõrgem mikrobioloogiliste külvidega registreeritud kõrgeimast E. coli kontsentratsiooni väärtusest. qPCR meetodiga saadud tulemused olid biosensori tulemustustest orienteeruvalt 4 korda madalamad. Biosensori signaali kõrged väärtused on tingitud sellest, et biosensor määrab nii elusaid, surnuid kui ka „uinunud“ bakterirakke, kuid lisaks registreerib teatud määral ka lagunenud rakkude membraani fragmentidel asetsevaid membraanvalke ning oma osakaalu annavad signaalile ka mittekultiveeritavad kolivormsed bakterid. Biosensoriga analüüsiti kolivormsete bakterite ja erinevatel meetoditel lagundatud E. coli rakkude mõju poolt avalduvat efekti biosensori signaalile. Selgus, et kasutatud polüklonaalne anti- E. coli antikeha omas lisaks E. coli bakteritele afiinsust ka kolivormsete mikroorganismide suhtes. qPCR tulemuste alusel arvutatud signaalimuutuste osakaalud langesid katsevigade piires hästi kokku biosensoriga saadud tulemustega, viidates sellele, et mittekultiveeritavate bakterite signaal on suuresti põhjustatud osaliselt lagunenud E. coli bakteritest. Kolivormsete bakterite suurim efekt biosensori signaalile avaldus sügisel kogutud 40 proovides (13.09.2018). Nii mehhaaniliselt ultrahelisondiga kui keemiliselt SDS- detergendi ja lüsosüümiga lagundatud E. coli rakkude mõju analüüsimise tulemustest selgus, et biosensori signaalile avaldus nende mõõdetav mõju seni kuni lagundamisprotsessidega jõuti raku peptidoglükaankihi lagundamiseni lüsosüümiga. Väljapakutud biosensortehnoloogia on heaks stardiplatvormiks suplusvee ohutuse kiireks kohapealseks hindamiseks. Ohutuskriterimite täpsemaks formuleerimiseks oleks edaspidi vaja põhjalikumalt iseloomustada erinevate bakteriliikide poolt põhjustatud signaali muutusi, samuti elusate ja surnud mikroorganismide sessoonseid osakaalude muutusi biosensori signaalis. Kui osutub vajalikuks biosensori määramispiiri alandamine, on võimalik seda lihtsalt teha proovi ruumala suurendamisega, mis ei vaja mingeid täiendavaid protseduure kui pikendab proovi voolutamiseks (ja seega ka analüüsiks) kuluvat aega. Aparatuuri mõõtmete vähendamisel on võimalik analüüsiseadmete loomine veeproovide automaatseks kohapealseks monitooringuks.