Development of assay systems for studying ligand binding to dopamine receptors

Abstract

Polüsahhariidid, nukleiinhapped ja valgud on eluks vajalikud biopolümeerid. Inimese organismis on neist kõige enim valke, mis on ühtlasi ka kõige mitmekülgsemad biomolekulid, seda nii oma struktuuri kui ka funktsiooni poolest. Valgud vastutavad mitmete eluks vajalike funktsioonide läbiviimise eest. Näiteks ensüümvalgud kiirendavad organismis toimuvaid keemilisi reaktsioone. Lisaks on valgud olulised ainete transportijad, pakuvad mehaanilist tuge ja immuunkaitset ning osalevad närvisignaali ülekandes. Käesolevas töös keskenduti retseptorvalkude, täpsemalt G-valguga seotud retseptorite uurimisele. Need valgud paiknevad raku membraanis, kus need vahendavad närvisignaali ülekannet raku väliskeskkonnast raku sisemusse. Signaaliülekande toimumiseks peab retseptoriga seostuma teatud tüüpi keemiline ühend, mida nimetatakse ligandiks. Ligandi seostumine retseptorile põhjustab retseptori struktuuri muutumise, mis omakorda mõjutab raku sees olevaid signaalmolekule. Dopamiini retseptorid on G-valguga seotud retseptorite perekonda kuuluvad valgud, mis vahendavad inimese organismis mitmeid olulisi funktsioone. Häired dopamiinergilises signaaliülekandes võivad põhjustada mitmesuguseid haigusi, millest tuntuimad on skisofreenia ja Parkinsoni tõbi. Seetõttu on dopamiini retseptorid olulised ravimite sihtmärgid ning detailsed teadmised dopamiini retseptorite toimimise kohta on äärmiselt vajalikud. Antud töö käigus keskenduti katsesüsteemide arendamisele, eesmärgiga iseloomustada ligandide seostumist erinevatele dopamiini retseptoritele. Katseid viidi läbi nii natiivsete retseptoritega (koeproovid) kui ka erinevate rekombinantsete dopamiini retseptoritega, mille saamiseks kasutati erinevaid ekspressioonisüsteeme (imetajarakud, putukarakud, pungunud bakuloviirused). Retseptorite ja ligandide vaheliste interaktsioonide iseloomustamiseks rakendati mitmesuguseid, põhiliselt fluorestsentsil põhinevaid meetodeid.

Biopolymers, like polysaccharides, nucleic acids and proteins are essential for all living organisms. Besides water, proteins are the most abundant type of molecules in the human body. Proteins are also the most versatile of all biomolecules, performing many functions required for life. Some proteins have catalytic activity and function as enzymes, others serve as structural elements, signal receptors, or transporters that carry specific substances into or out of cells. This thesis focuses on the receptor proteins, specifically to G protein-coupled receptors that are located in the cell’s plasma membrane. These proteins are responsible for detecting signals outside the cell by binding various chemical compounds, called ligands. Ligand binding to a receptor can initiate a conformational change in the structure of the protein, which in turn leads to a chain of biochemical events inside the cell. Dopamine receptors, belonging to the family of G protein-coupled receptors, mediate several important functions in the human body. Abnormal dopaminergic signaling can lead to several neurological and psychiatric disorders, such as schizophrenia and Parkinson’s disease. Therefore, dopamine receptors are relevant drug targets and acquiring further information about the signal transduction process mediated by dopamine receptors is essential. This thesis focused on the development of novel assay systems to characterize ligand binding to different subtypes of dopamine receptors. Experiments were carried out with native receptors (tissue homogenates) and with various recombinant protein expression systems (mammalian and insect cells, budded baculovirus particles). Additionally, several methods were implemented to study receptor-ligand interactions with the emphasis on fluorescence-based methods.