Sirvi Autor "Ivan, Taavi" järgi

Nüüd näidatakse 1 - 5 5

Application of Responsive Photoluminescent Probes for Analysis of Dissociation Kinetics of Protein Kinase/Inhibitor Complexes
(Tartu Ülikool, 2013) Ivan, Taavi; Uri, Asko, juhendaja; Vaasa, Angela, juhendaja; Enkvist, Erki, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja tehnoloogiateaduskond; Tartu Ülikool. Keemia instituut
Bifunctional inhibitors and photoluminescent probes for studies on protein complexes
(2017-07-06) Ivan, Taavi; Uri, Asko, juhendaja; Viht, Kaido, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Inimraku elutegevus on reguleeritud keeruliste protsesside kaudu. Ühed kõige olulisemad informatsiooni edasikandvad muutused on valkudevahelised interaktsioonid ja valkude fosforüülimine. Valkude fosforüülimist teostavad proteiinkinaasid, mis katalüüsivad fosforüülrühma ülekannet nukleotiidilt (milleks on enamasti ATP) sihtvalgule. Kõrvalekaldeid proteiinkinaaside normaalsest aktiivsuses on seostatud komplekssete ja sageli raskesti ravitavate haigustega, näiteks erinevad neurodegeneratiivsed haigused (Parkinson, Alzheimer), südame- ja veresoonkonnahaigused, diabeet ning vähkkasvajad. Seetõttu on ravimitööstuse kõrgendatud tähelepanu suunatud proteiinkinaaside aktiivsuse reguleerimisele inhibiitoritega. Tänaseks päevaks on kasutusloa saanud enam kui 30 proteiinkinaaside inhibiitorit, mis on märkimisväärselt aidanud parandada vähktõbe põdevate inimesete elukvaliteeti ja elulemust. Käesoleva töö raames töötati välja ja iseloomustati mitmekülgseid ja tundlikke meetodeid, mis võimaldasid iseloomustada mitmete proteiinkinaaside aktiivsust biokeemilistes katsetes, inhibiitorite sidumise tugevust proteiinkinaasidele, proteiinkinaas:inhibiitor kompleksi lagunemise kiirust ja jälgida reaalajas proteiinkinaasi aktiivsust imetajarakkudes. Eriliseks teeb meetodid nendes rakendatud orgaaniline sond ARC-Lum, millel on unikaalsed optilised omadused. Esiteks, proovi ergastamisel kiirgub valgust vaid juhul, kui ARC-Lum sond on kompleksis proteiinkinaasiga. Teiseks, kiirgunud valgusel on pikk eluiga, mis võimaldab vähendada mittespetsiifilise signaali mõjusid. ARC-Lum sondi rakendamisel arendati uudse struktuuriga bifunktsionaalsed ARC-tüüpi inhibiitorid, mis saavutasid senikirjeldatud inhibiitoritest kõrgeima afiinsuse proteiinkinaasi PKAc suhtes (Kd < 10 pM). Võrreldes ravimina kasutatavate inhibiitoritega inhibeerivad uued ained proteiinkinaase oluliselt (kuni tuhat korda) madalamatel kontsentratsioonidel. Arendatud inhibiitorite võimekust demonstreeriti väga tugeva valkudevahelise interaktsiooni lõhkumisel ja pakuti välja uudne lahendus sihtida tugevaid valkudevahelisi interaktsioone bifunktsionaalsete inhibiitoritega
Joint application of an ARC-probe and antibody in homogeneous TR-FRET assay for determination of the concentration of protein kinase Pim2
(Tartu Ülikool, 2016) Pagkeu, Sylvestre Tc; Ivan, Taavi; Uri, Asko; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Förster resonance energy transfer (FRET) is a routinely apply photoluminescence technology in high throughput screening in drug discovery. It involves the transfer of energy between two luminescence molecules, the donor and the acceptor in close proximity. In this thesis, we describe the application of the approach exploiting time-resolved measurement of intensity of FRET (TR-FRET) from terbium donor luminophore to fluorescent dye Alexa Fluor 647, for the measurement of the concentration of a specific protein kinase Pim2 in a solution-phase homogenous assay. This method is based on the simultaneous binding of a specific PK to both a luminophore ARC-type probe inhibitor and a fluorescently labelled monoclonal antibody specific to the PK. In case specific IgG labelled with Alexa Fluor 647 acting as acceptor fluorophore is combined in solution with donor luminophore (lanthanide chelate labelled) ARC-probe and the protein kinase of interest, the formation of a triple complex antibody:protein kinase:ARC-probe can be measured by time-resolved measurement of FRET intensity. First, we were able to determine the active concentration of the PK, using a flurescently labelled ARC-type inhibitor of the PK’s active site. Second, we were able to prove the detection of a specific PK by formation of high a FRET signal between a luminophore ARC-type probe PK inhibitor as donor and a fluorescently labelled antibody specific to the PK as acceptor. In addition, formation of the triple complex between ARC-type inhibitor:PK:mAb(Pim2) was confirmed by addition of another ARC-type inhibitor in the well were maximal FRET signal ratio was observed. The determined limit of quantification of the assay was 8 nM, that points to high sensitivity of this homogeneous analytical method. The approach described in this thesis, could be used as a rapid medical diagnostic tool for PK detection and analysis.
Proteiinkinaaside kvantifitseerimine immobiliseeritud ARC-Lum(Fluo) sondidega
(Tartu Ülikool, 2017) Zadorožnaja, Anna; Ivan, Taavi; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Keemia instituut
Käesoleva töö eesmärgiks oli välja töötada aktiivse proteiinkinaasi kontsentratsiooni määramise meetod. Meetod põhineb PKA ja teiste AGC rühma kinaaside suhtes kõrge afiinsusega biotinüleeritud ARC-Lum(Fluo) sondide kasutamisel. Kompleksis sihtmärkvalguga muutuvad ligandi luminestsentsomadused tugevalt, võimaldades aktiivse kinaasi kontsentratsiooni määramist. ARC-Lum(Fluo) sondide pikk eluiga võimaldab aeglahutusega luminestsentssignaali mõõtmist, millega saavutatakse parem signaal-müra suhe ning kõrgem tundlikkus. Välja töötatud meetod on lihtne, kiire, madala reagentide kuluga ja lubab pikomolaarsete kinaasi kontsentratsioonide tuvastamist ja kvantifitseerimist.
Proteiinkinaaside spottimine pinnale ja kvantifitseerimine ARC-tüüpi sondiga
(Tartu Ülikool, 2017) Pupart, Hegne; Ivan, Taavi; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Keemia instituut
Töö eesmärgiks oli uurida ARC-tüüpi sondiga proteiinkinaasi (PK) aktiivse hulga määramise võimalikkust proovi pinnale adsorbeerimise kaudu. Optimaalsete tingimuste leidmiseks uuriti muuhulgas erinevate pindade sidumismahtu, lahuse komponentide ja inkubeerimisaja pikkuse mõju katseetappides. Meetodit katsetati kolme erineva kinaasiga: PKAc, ROCK2 ning MSK1. Tutvustatav meetod on lihtsa teostatavusega ja võimaldab tuvastada aktiivse kinaasi hulka pikomoolides. Kuigi ARC-sondi põhise tuvastusmeetodiga, esinesid võrdlemisi suured erinevused paralleelkatsetes. Leiti, et adsorbeerunud aktiivse PK analüüsimine on võimalik. Meetodit saab rakendada erinevate PK-de puhul paralleelselt ja töö käigus selgunud tingimuste mõju annab olulist teavet meetodi edasiarendamiseks.