Browsing by Author "Merits, Andres, juhendaja"

Now showing 1 - 19 of 19

Alfaviiruste replikaasi jagamine funktsionaalseteks komponentideks Sindbis, Chikungunya ja Ross River viiruste näitel
(Tartu Ülikool, 2018) Lello, Laura Sandra; Merits, Andres, juhendaja; Utt, Age, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Alfaviirused on Togaviridae sugukonda kuuluv positiivse polaarsusega RNA genoomsete viiruste perekond. Alfaviiruste genoom kodeerib mittestruktuurseid valke, mis sünteesitakse liitvalguna. Funktsionaalne replikaas moodustub liitvalgu lõikamise teel. Seni ei ole suudetud sellist kompleksi individuaalsetest komponentidest konstrueerida. See ajendas meie uurimisgrupi ning Antwerpeni Troopilise Meditsiini Instituudi teadlaseid uurima alfaviiruste replikaasi rekonstrueerimist valmis- ja liitvalkudest ning RNA maatritsist. Käesoleva töö eesmärgiks oli selleks vajalike töövahendite kavandamine, valmistamine ning katsetamine. Analüüsiti kahest ja kolmest komponendist moodustatud replikaaside funktsionaalsust. Lisaks määrati replikaasi kompleksi moodustavate komponentide optimaalsed vahekorrad ja uuriti, kas sellised replikaasid säilitavad oma bioloogilised omadused. See bakalaureuse töö näitab Ross River, Sindbis ja Chikungunya viiruste näidetel, et nende replikaase saab rekonstrueerida kahest- ja mõnel juhul ka kolmest komponendist ning rajab seega aluse alfaviiruste replikaasi moodustumise ja toimimise põhjalikuks uurimiseks.
Alfaviiruste RNA sünteesiks vajalike determinantide uurimine matriits-RNAde ja replikaaside kombinatsioonide abil
(Tartu Ülikool, 2020) Lello, Laura Sandra; Utt, Age, juhendaja; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Alfaviirused on Togaviridae sugukonda kuuluv arboviiruste perekond. Alfaviiruste genoom sisaldab kahte avatud lugemisraami, millest esimene kodeerib mittestruktuurseid ning teine struktuurseid valke. Mittestruktuurselt regioonilt sünteesitakse replikaasi eellane – mittestruktuurne liitvalk, mis enne funktsionaalsuse saavutamist läbib proteolüütilise töötlemise. Alfaviiruste replikaas osaleb RNA replikatsioonil olulistes interaktsioonides ciselementidega genoomi otstes ning lugemisraamide vahelises alas. Käesolevas magistritöös kasutati usaldusväärset trans-replikatsiooni süsteemi uurimaks üheksa alfaviiruse näitel replikatsiooniks vajalike determinantide paiknemist genoomis. RNA matriitside ning replikaaside kombineerimise teel tehti kindlaks, et SFV kompleksi kuuluvad replikaasid replitseerivad ning transkribeerivad efektiivselt nii SFV kompleksi kuuluvate kui ka kompleksi välisete viiruste RNA matriitse. Samas, kompleksi väliste viiruste replikaaside käitumine oli spetsiifilisem. Sindbis viiruse/Chikungunya viiruse hübriitsete matriitside abil tehti kindlaks, et replikatsiooni ja transkriptsiooni viirus-spetsiifilisuseks vajalikud determinandid paiknevad vastavalt genoomi 5’ UTR esimeses juuksenõelastruktuuris (SL3) ja subgenoomse promootori regioonis.
Alphaviral nsP2 protease: from requirements for functionality to inhibition
(2023-05-09) Rausalu, Kai; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Alfaviirused on umbes 70 nm diameetriga RNA genoomiga viirused (perekond Alphavirus, sugukond Togaviridae). Üks alfaviirustest on Chikungunya viirus (CHIKV), mis põhjustab haigust, millega kaasnevad piinavad liigesevalud kestavad sageli kuid peale haigestumist. Leevendamaks CHIKV haigusest põhjustatud kannatusi on oluline leida viirusvastaseid ühendeid, mis takistaksid CHIKV paljunemist rakkudes. Selleks on vaja mõista, kuidas kulgeb CHIKV elütsükkel rakkudes. nsP2 on üks CHIKV valkudest, millel on CHIKV infektsiooni ajal mitu funktsiooni. nsP2 on viiruse proteaas ja RNA helikaas, nsP2 osaleb ka raku viirusvastase immunvastuse maha surumises. Proteaasina on nsP2 see viirusvalk, mis lõikab viiruse mittestruktuurse liitvalgu individuaalseteks valkudeks. See protsess on kesksel kohal viiruse elutsükli regulatsioonis. Selle doktoritöö raames uuriti, mis on CHIKV nsP2 proteaasi nõuded funktsionaalsuseks. Leiti, et CHIKV nsP2 on tsüsteiin-proteaas, mis sarnaneb varemuuritud teiste alfaviiruste nsP2 proteaasidega. CHIKV nsP2 aminohappelises järjestuses on tsüsteiin 478 vältimatult vajalik proteaasi aktiivsuse olemasoluks ning kui see tsüsteiin või selle kõrval asuv trüptofaan 479 asendada alaniiniga, siis kaotab CHIKV nsP2 oma proteaasi aktiivsuse. Alfaviiruste mittestruktuurse liitvalgu lõikamine on ajaliselt reguleeritud protsess. Uurisime kuidas mõjutab viiruse mittestruktuursete valkude vaheliste lõikamiste toimumise kiiruse muutmine Semliki Forest viirust (SFV) ning Sindbis viirust (SINV). Leidsime, et SFV ning SINV jaoks on oluline, et viirusvalkude nsP1 ja nsP2 vaheline lõikamine ei toimuks liiga kiiresti. Kiirendatud lõikamine kahandas nende viiruste nakatamisvõimet ning vähendas viiruse RNA-de sünteesi. Viimasena osa doktoritööst moodustab ühe varem-tuntud CHIKV-inhibeeriva ühendi põhjal sünteesitud uudsete potentsiaalsete CHIKV inhibiitorite analüüs, mille tulemusena leiti ühend, mille CHIKV-vastane toime on umbes kümme korda parem kui lähteühendil.
Bakteriofaag T7 transkriptsioonisüsteemi kasutamine Semliki Forest viiruse genoomi ja replikon-süsteemi RNA-de vabastamiseks plasmiidsetest vektoritest eukarüootses rakus
(Tartu Ülikool, 2013) Hensen, Kati; Utt, Age, juhendaja; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool, Loodus- ja tehnoloogiateaduskond; Tartu Ülikool, Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Barmah Forest viiruse mutantide iseloomustamine in vitro ja in vivo
(Tartu Ülikool, 2020) Omler, Ailar; Merits, Andres, juhendaja; Mutso, Margit, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Barmah forest viirus (BFV) on Austraalias ulatuslikult leviv artriite põhjustav alfaviirus, mis põhjustab igal aastal ligikaudu 1000 registreeritud haigusjuhtu. Käesolevas töös kirjeldati lähemalt BFV nsP3 tuumalokalisatsiooni ja näidati, et see sõltub C-terminaalses domeenis paiknevast tuumalokalisatsiooni signaalist. Näidati ka seda, et nsP3 lokalisatsioon rakutuuma leiab aset imetajarakkude nakatamisel, kuid mitte putukarakkudes. Samuti ei mõjutanud selle omaduse puudumine viiruse replikatsioonikineetikat putukarakkudes. nsP3 tuumalokalisatsiooni signaali häirimine põhjustas BFV atenueerimist tüüp I IFN kompetentsete rakkude nakatamisel ning madalamaid viiruse tiitreid nakatatud C57BL/6 hiirte kudedes. Sellest järeldati, et BFV nsP3 lokalisatsioon rakutuuma võib mõjutada peremeesraku geeniekspressiooni ja/või tüüp I IFN süsteemi kaudset viirusvastase oleku kujunemist. Lisaks iseloomustati kahe nsP2 ja nsP4 järjestuses paikneva mutatsiooni mõju BFV replikatsioonile ning nende positsioonide olulisust seostati tüüp I IFN vastuse allareguleerimisega peremeesrakus.
Chikungunya viiruse mittestruktuurse valgu nsP3 ja raku valgu CD2AP vahelise interaktsiooni uurimine
(Tartu Ülikool, 2015-09-01) Tarve, Liisi; Merits, Andres, juhendaja; Varjak, Margus, juhendaja; Mutso, Margit, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja tehnoloogiateaduskond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Construction and functional analysis of stable cell lines expressing nsP1 of alphaviruses
(Tartu Ülikool, 2023) Mirzajani Sarvandani, Mandana; Wang, Sainan, juhendaja; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Tehnoloogiainstituut
Alphaviruses are positive-strand RNA viruses that are transmitted by mosquitoes and cause various (often serious) diseases in their vertebrate hosts, including humans. Similar to other positive-strand RNA viruses, alphaviruses encode for RNA replicase. RNA replicase of alphaviruses consists of four virus-encoded subunits, called non-structural proteins 1-4 (nsP1-4). nsP1 is a membrane anchor or the replicase complex. It forms a dodecameric ring that holds other components in their place, its guanine-7-methyltransferase (MTase) and guanylyltransferase (GTase) activities are essential for the capping of viral RNA genomes. In this study, tetracycline-inducible stable cell lines expressing nsP1 or its mutants of different alphaviruses were generated. Trans- complementation assay was performed by supplementing homologous or heterologous wild-type nsP1 or its mutant version to functionally defective replicase of Chikungunya virus (CHIKV) in which the defect was caused by mutations of nsP1. We found that expression of wild-type nsP1 of matching or closely related alphaviruses can significantly compensate for capping defects of CHIKV replicase. The compensation was less effective, or not observed at all, for replicase mutants where the defect was due to its compromised membrane attachments. Adding the defective nsP1 to the CHIKV replicase which harbours the same mutation worsens the activity of replicase; however, activities of mutated replicase were restored when it was supplemented with nsP1 harbouring different functional defects. Furthermore, expression of these findings expands our knowledge about alphavirus RNA replication and trans-complementation of replicase-associated defects. Besides, tetracycline-inducible stable cell lines can be used as tools to trans-complement alphaviruses with lethal defects in nsP1 allowing obtaining conditionally infectious alphaviruses virions which can be used at low biosafety level laboratories for high-throughput neutralization and antiviral testing.
Different Approaches to Counteracting Hepatitis C Virus and Chikungunya Virus Infections
(2016) Mutso, Margit; Žusinaite, Eva , juhendaja; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja tehnoloogiateaduskond.
Tänapäeval on võimalik ennast erinevate viiruste vastu vaktsineerida ning ka viirushaiguste ravi on muutunud oluliselt tõhusamaks. Samas leidub endiselt meditsiiniliselt olulisi viiruseid, mille vastu puudub vaktsiin ja/või mille poolt põhjustatud haigustele pole siiani adekvaatset ravi. Viirus-vastaste ühendite ja vaktsiinide väljatöötamist raskendavad nii viiruste suur mitmekesisus kui ka nende keeruline elutsükkel. Üheks selliseks viiruseks on C hepatiidi viirus (HCV), mis on kroonilise maksahaiguse levinuimaks tekkepõhjuseks. Hinnanguliselt on selle viirusega krooniliselt nakatunud ~3% inimkonnast. Kuigi HCV infektsiooni ravis on toimunud suur läbimurre, on viiruse geneetilise mitmekesisuse, ravimresistentsete vormide tekkimise ning patsientide ravile mitteallumise tõttu endiselt väga oluline uute HCV vastaste ravimite väljatöötamine. Antud uurimustöö üheks eesmärgiks oli analüüsida erinevaid tehnoloogilisi lahendusi HCV vastaste ühendite loomiseks. Ühe lähenemisena valiti FQSAR arvutiprogrammi põhiselt välja madal-molekulaarsed ühendid, mis seondudes HCV NS3/4A proteaasiga inhibeerivad HCV replikatsiooni, ja iseloomustati nende mõju viiruse infektsioonile. Kõik analüüsitud seitse ühendit omasid HCV-vastast efekti, kuid ainult üks ühend (23332) oli kasutatavas kontsentratsioonis mitte-toksiline. Teine lähenemisviis seisnes looduslikult esineva modifikatsiooni (8-oxo-dG) mõju analüüsimises oligonukleotiidsete (ON) inhibiitorite efektiivsusele. Kombineerides erinevaid modifikatsioone leiti ON ühend, mis inhibeeris HCV replikatsiooni nanomolaarsetel kontsentratsioonidel. Lisaks HCV uurimisele on võimalik käsitletud lähenemise kasutada ka teiste viiruste vastu suunatud ühendite väljatöötamisel. Chikungunya viirus (CHIKV, perekond Alfaviirus) on troopilistes piirkondades leviv arboviirus, mis on viimasel aastakümnel korduvalt väljunud oma tavalisest levialast ja põhjustanud epideemiaid erinevates maailmajagudes. Antud töö kolmandaks eesmärgiks oli analüüsida uudsete CHIKV-vastaste vaktsiinikandidaatide geneetilist stabiilsust ning uurida nendes sisalduvate viirust nõrgestavate mutatsioonide mõju CHIKV elutsüklile. Leiti, et viirustel CHIKVΔ5nsP3 ja CHIKVΔ6K on nõrgestatud fenotüüp ka pärast mitmekordset passeerimist koekultuuri rakkudes. Mitmetest analüüsitud CHIKV-vastastest vaktsiini kandidaatidest osutus kõige efektiivsemaks CHIKVΔ5nsP3. See nõrgestatud viirus sisaldab suurt deletsiooni nsP3 valgu C-terminaalses regioonis. Katsetest selgus, et nimetatud regioon interakteerub sama valgu keskmise domeeni ning nsP2 valgu C-terminaalse osaga ja need kontaktid on olulised viiruse replikatsioonil. Need avastused võimaldavad edaspidi välja selgitada CHIKVΔ5nsP3 mitte-patogeense fenotüübi põhjused. CHIKV Δ5nsP3 vaktsiini tüvi on kasutusele võetud edasiseks arendamiseks farmatseutilise firma poolt.
New insights into alphaviral nsP2 functions
(2023-01-12) Cherkashchenko, Liubov; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Alfaviirused (sugukond Togaviridae) on sfäärilise ümbrisega virionide ja positiivse polaarsusega RNA genoomiga viirused, mis enamasti levivad lülijalgsete vektorite vahendusel. Paljud alfaviirused on olulised inimeste patogeenid, sealhulgas ulatuslikke puhanguid põhjustav Chikungunya viirus (CHIKV), Austraalias leviv Ross River viirus (RRV), Ameerikas leviv ida hobuste entsefaliidi viirus (EEEV) ja ka Eestis leiduv Sindbis viirus (SINV). Alfaviiruste põhjustatud haigused sõltuvad viiruse liigist ja selle päritolust,kus üldistatult põhjustavad Vana Maailma alfaviirused palaviku, löövet ja artriiti, samal ajal kui Uue Maailma alfaviirused on sageli kõrge patogeensusega põhjustades neuroloogilisi haiguseid, sealhulgas entsefaliiti. Alfaviiruste RNA genoom kodeerib nelja viiruse RNA replikaasi allühikut, mis toodetakse liitvalgust eellase (polüproteiini) kujul. Liitvalk lõigatakse neljaks valmis replikaasi valguks viiruse nsP2 proteaasi abil. Viimastel aastakümnetel läbiviidud uurimistööd on võimaldanud välja selgitada viiruse replikaasi kompleksi kui ka selle komponentide peamised funktsioonid ning meie arusaamine viiruse valkude struktuuridest on oluliselt täienenud. Ka need uurimised on näidanud, et alfaviiruse infektsiooni üks esimesi ja kõige olulisemaid sündmusi on replikaasi valkude eellase lõikamine valmis valkudeks. Eelvalgu lõikamised toimuvad kindlas järjekorras ja onkindlalt ajastatud, mis määrab ära selle, kas vabanevad valgud moodustavad toimiva RNA replikaasi või mitte. Seega kujutab eelvalgu lõikamise protsessi läbi viiv nsP2 endast RNA replikatsiooni käivitamise ja efektiivsuse regulaatorit. Samas on tegemist multifunktsionaalse valguga, mis on lisaks RNA sünteesi reguleerimisele oluline nii raku viirusvastaste kaitsereaktsioonide aktiveerimisel kui ka nende mahasurumiseks. Sellest tulenevat mõjutavad muudatused nsP2 valgus, sealhulgas punktmutatsioonid valgu funktsionaalselt olulistes regioonides, oluliselt viiruse bioloogilisi omadusi. Seejuures ei ole mitmete nsP2 aktiivsuste taga seisvad molekulaarsed mehhanismid lõpuni selged. Küll aga on selgunud, et nsP2 funktsioone mõjutavad interaktsioonid alfaviiruse ülejäänute replikaasi valkude nsP1, nsP3 ja nsP4-ga. Käesoleva uurimistöö raames selgitati välja ja analüüsiti mitmeid nsP2 valgu ja RNA replikaasi seni tundmatuid funktsioone. Töö peamised tulemused saab kokku võtta järgnevalt: 1. alfaviiruste genoomide alusel konstrueeritud trans-replikatsiooni süsteemid võimaldavad uurida nsP2 valgu funktsioone, mis on seotud viiruse RNA replikaasi kompleksi moodustamisega, aga ka selle moodustamise blokeerimise ja/või selle aktiivsuse mahasurumisega. Viimati nimetatud aktiivsused on olulised viiruste superinfektsiooni blokeerimisel ja tõenäoliselt ka viiruse replikatsiooni ajalisel reguleerimisel. CHIKV ja SINV trans-replikatsiooni süsteeme kasutades tehti kindlaks, et superinfektsiooni blokeerimise puhul on võtmesündmuseks ühe viiruse replikaasi eellase lõikamine teise viiruse nsP2 poolt ja et seda mõjutavad mutatsioonid nii sihtmärk-liitvalgus kui ka nsP2 valgus; 2. leiti, et individuaalse nsP2 süntees sääse (vektorputuka) rakkudes surub maha alfaviiruse replikatsiooni aktiivsust. Seda nähtust ei põhjusta ainult nsP2 proteaasne aktiivsus – olulised on ka nsP2 proteaassest aktiivsusest sõltumatud mehhanismid. See, milline on konkreetsete mehhanismide osakaal, sõltub nii viiruse RNA replikaasi kui ka selle moodustamist inhibeeriva nsP2 valgu päritolust. Homoloogse viiruse replikatsiooni mahasurumisel domineerib nsP2 proteaassest aktiivsustest sõltuv mehhanism, kus nsP2 poolt teostatud replikaasi eelvalgu lõikamine 2/3 saidist välistab funktsionaalse RNA replikaasi moodustumise. Mõne alfaviiruse (SINV) puhul on nsP2 proteaassest aktiivsusest sõltuv mehhanism ka peamiseks mehhanismiks millega surutakse alla heteroloogsete alfaviiruste replikaaside moodustamist; 3. nii SINV kui ka CHIKV nsP2 valk takistab heteroloogsete alfaviiruste RNA replikatsiooni ka proteaassest aktiivsusest sõltumatute mehhanismide abil, kus CHIKV nsP2 puhul on need peamisteks meetoditeks heteroloogsete alfaviiruste replikatsiooni mahasurumisel. Selle inhibeerimise täpne põhjus on hetkel teadmata, küll aga näitasime, et erinevad mutatsioonid nsP2 valgus mõjutavad taolise inhibeerimise efektiivsust. Need andmed viitavad sellele, et proteaassest aktiivsusest sõltumatu replikatsiooni inhibeerimine saavutatakse tõenäoliselt mitmete paralleelsete mehhanismide abil; 4. väga patogeensele ja seetõttu vähe uuritud EEEV-le konstrueeritud trans-replikastiooni süsteem osutus kõrgelt efektiivseks nii inimese kui ka sääse rakkudes. Samuti osutus võimalikuks EEEV replikaasi eelvalku (P1234) kodeeriva järjestuse jagamine kaheks (P123 + nsP4) ja kolmeks (nsP1+P23+nsP4) komponendiks. See võimaldas uurida kas ja kuidas replikaasi komponentide vahekord mõjutab EEEV RNA replikaasi aktiivsust. Läbiviidud katsed näitasid, et erinevalt seni uuritud alfaviirustest sõltub EEEV RNA replikaasi aktiivsus teda moodustavate komponentide optimaalsest vahekorrast ja et RNA replikaasi katalüütilise allühiku (nsP4) ülehulk vähendab EEEV RNA replikaasi aktiivsust. Selline aktiivsuse langus tuleneb sellest, et väheneb nii rakkude hulk milles RNA replikatsioon aktiveeritakse, kuid ka RNA replikatsiooni aktiivsus nendes rakkudes. Hetkel pole veel selge kas tegemist on EEEV RNA replikaasi unikaalse omadusega või leidub ka teisi sarnaste omadustega alfaviiruste replikaase; 5. uuriti RRV loodusliku isolaadi RRV 2528 omadusi. Leiti, et see viiruse isolaat põhjustab väga tugevat tüüp-I interferoonide vastust. Viiruse genoomi analüüs tõi välja, et RRV 2528 erineb teistest vähemal määral interferoonide tootmist indutseerivatest RRV isolaatidest mitmete mutatsioonide poolest, millest paljud paiknevad just nsP2 valgus Näitasime, et need mutatsioonid mõjutavad RRV nakkuse käigus toimuvat interferoonide tootmist, kuid ei mõjuta viiruse replikaasi eelvalgu protsessimist valmis valkudeks, viiruse võimet suruda maha raku valgusünteesi ega viiruse struktuurvalkude sünteesi. Seega ei tulene suurenenud tüüp-I interferoonide vastus defektist RRV 2528 RNA replikatsioonikomplekside moodustamisel või võimetusest maha suruda raku üldist geeniekspressiooni.
Role of alphavirus replicase in viral RNA synthesis, virus-induced cytotoxicity and recognition of viral infections in host cells
(2016-05-24) Utt, Age; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond.
Alfaviirused on positiivse polaarsusega RNA genoomsed viirused. Alfaviiruste levik selgroogsete peremeeste vahel toimub enamasti lülijalgsete vektorite vahendusel. Alfaviiruste perekonda kuulub ka suure meditsiinilise tähtsusega Chikungunya viirus (CHIKV). CHIKV infektsiooni iseloomustab kõrge palavik, lööve ja lihasevalu, eriti iseloomulik on aga liigesevalu, mis võib muutuda krooniliseks ning kesta kuid või isegi aastaid. Praeguseks hetkeks puudub selle viiruse vastane vaktsiin või spetsiifiline ravim, võimalik on leevendada vaid sümptomeid. Kliima muutused ja ülemaailmne reisimine on võimaldanud CHIKV-l levida ka piirkondadesse, kus teda varem ei ole olnud. Näiteks jõudis CHIKV 2013. aasta lõpus Ameerikasse, kus tema levik on võtnud epideemia mõõtmed. Seetõttu on CHIKV uurimine intensiivistunud, kuid siiski on tema kohta käivad teadmised lünklikud ja ebapiisavad. Selleks, et välja töötada CHIKV vastaseid vaktsiine või ravimeid tuleb esmalt põhjalikult uurida tema molekulaarbioloogiat ja, mis veelgi olulisem, mõista kuidas CHIKV ja tema peremees teineteist vastastikku mõjutavad. Paraku on tegemist ohtliku patogeeniga, mille töötamine on raskendatud kõrgest bioohutuse tasemest tulenevate tingimuste tõttu. Seetõttu on CHIKV uuringuteks eriti vajalikud ohutud ja samas ka efektiivsed tööriistad. Seega antud uurimustöö eesmärgiks saigi selliste tööriistade väljatöötamine, mis hõlbustaksid CHIKV uurimist. Esmalt konstrueerisime mittetsütotoksilised CHIKV replikonid, mis võimaldavad neid sisaldavate rakkude järjepidevat paljunemist. Töö käigus loodi püsiliinid ja tehti kindlaks erinevad mutatsioonide kombinatsioonid nsP2 valgus, mis vähendasid CHIKV replikoni tsütotoksilisust. Iseloomustati ka mutatsioonid nsP1 ja nsP3 valkudes, mis võimaldasid mittetsütotoksilise CHIKV replikoni püsimist inimese rakkudes. Läbiviidud analüüsid näitasid, et mutatsioonid nsP2 valgus mõjutavad selle ensümaatilisi aktiivsuseid ning vähenenud tsütotoksilisusega fenotüübid erinevad molekularsete mehhanismide poolest. Lisaks leiti, et sellised stabiilsed ja markervalke tootvad rakuliinid kujutavad endast efektiivseid ja ohutuid tööriistu, mis võimaldavad CHIKV vastaste inhibiitorite otsimist ja nende toime analüüsimist. Teiseks töötasime välja uudse CHIKV põhise trans-replikaasi süsteemi, kus replikaasi valkude tootmine ja nende poolt läbiviidav RNA paljundamine on teiseteisest lahutatud. Näitasime, et selline süsteem võimaldab uurida erinevate mutatsioonide või mittestruktuursetele valkudele lisatud tagide otseseid efekte replikaasi võimele läbi viia RNA sünteesi. Võrrelduna infektsioonilise viirusega omab CHIKV trans-replikaas sellistes analüüsides selgeid eeliseid, sest viiruse kontekstis põhjustavad paljud mutatsioonid geneetilist ebastabiilsust. Lisaks leidsime, et konstueeritud trans-replikaasi süsteem võimaldab väga edukalt uurida viiruse ja peremeesraku vahelisi interaktsioone. SFV trans-replikaasi kasutades avastasime alfaviiruste replikaasi uue funktsiooni – võime kasutada rakulisi RNAsid sünteesimaks kaasasündinud immuunvastust aktiveerivaid kaheahelalisi RNA molekule. Samas aga selgus huvitav tõsiasi, et CHIKV replikaas ei ole võimeline meie poolt kirjeldatud viisil immuunsüsteemi aktiveerima. Seega leidsime, et kahe väga sarnase alfaviiruse äratundmine peremeesraku poolt toimub väga erineval moel. Käesoleva uurimustöö käigus on loodud rida unikaalseid ja efektiivseid CHIKV molekulaarbioloogia uurimise tööriistu. Nende kasutamine on võimaldanud paremini mõista nii CHIKV molekulaarbioloogiat kui ka alfaviirus - peremees vahelisi interaktsioone.
Ross River viiruse infektsiooni visualiseerimine alfaviiruse valkude vastaste antikehade, lutsiferaaside ja fluorestseeruvate valkude abil.
(Tartu Ülikool, 2016) Noorem, Anni; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja tehnoloogiateaduskond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Alfaviirused on mitmekesine perekond putukatega levivaid RNA viiruseid. Mõned alfaviirused (Semliki Forest viirus, Chikungunya viirus) on suhteliselt hästi uuritud, paljudest pole aga peaaegu midagi teada. Ka lihase- ja liigesevalusid, põletikku ja löövet põhjustav Ross River viirus (RRV) kuulub väheuuritud alfaviiruste hulka. Austraalias diagnoositakse igal aastal üle 5000 RRV nakkusjuhumi. See ajendas Griffith Ülikooli virolooge koostöös Tartu Ülikooli Tehnoloogiainstituudi RNA viiruste uurimisgrupiga RRV-d põhjalikumalt uurima. Selle töö esimeseks etapiks oli vajalike töövahendite valmistamine ja katsetamine. Töövahendite kavandamiseks kasutati nii paremini uuritud alfaviiruste kohta käivaid andmeid kui ka katse ja eksituse meetodit. Käesolevas bakalaureusetöös saadud andmed aitavad paremini mõista RRV-d kui viirust. Loodud töövahendid ja meetodid on vajalikud RRV põhjalikumaks uurimiseks, mis on omakorda aluseks RRV ja teiste väheuuritud alfaviiruste poolt tekitatavate haiguspuhangutega paremaks toimetulemiseks.
Semliki Forest viiruse mittestruktuurse valgu nsP1 palmitüleerimis-defektsete mutantide funktsionaal-struktuurne iseloomustamine
(2005) Tints, Kairit; Merits, Andres, juhendaja
Semliki Forest viiruse mittestruktuurseid valke ekspresseerivate rakuliinide konstrueerimine ja iseloomustamine
(2004) Hääl, Ingrid; Merits, Andres, juhendaja
Structure-guided insights into the functions of CHIKV nsP2
(2024-01-10) Wang, Sainan; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Alfaviirused on positiivse polaarsusega RNA genoomi ja ümbrisega viirused mis on vastutavad paljude inimeste ja loomade haiguste eest. Üks meditsiiniliselt olulisemaid alfaviiruseid on chikungunya viirus (CHIKV). Selle viiruse põhjustav chikungunya palavik on äge haigus millega tavaliselt kaasneb lööve ja liigesevalud, ja millele sageli järgneb kuid või isegi aastaid kestev krooniline faas. Viimase kahekümne aasta jooksul on CHIKV põhjustanud miljoneid nakkusjuhtumeid enam kui 50-s riigis ja temast on saanud ülemaailmse tähtsusega patogeen. Litsentseeritud ravimid CHIKV põhjustatud haiguse raviks puuduvad. Alfaviiruse genoomse RNA replikatsioon sõltub RNA sünteesi ja modifikatsiooni protsessist mida viivad läbi viiruse poolt kodeeritud mitte-struktuurvalgud (nsP-d). nsP2 valku peetakse RNA replikatsiooni võtmevalguks ja peamiseks regulaatoriks. Siiski olid nsP2 valgu ensümaatiliste aktiivsuste ja muude funktsioonide omavahelised seosed ebapiisavalt uuritud. Käesolev uuring selgitas välja nsP2 valgus struktuuri mis võimaldab paremini mõista selle valgu funktsioone alfaviiruse replikatsioonis. Samuti näitasime, et nsP2-d saab kohandada täiendavate viiruse replikatsiooni jaoks oluliste funktsioonide täitmiseks. Selle uurimistöö peamised järelduse on järgnevad: 1: Tuvastasime kriitilised aminohapped jäägid, mis vahendavad „stacking“ interaktsioone nsP2 valgu ja CHIKV genoomi 3' otsa vahel. Nende interaktsioonide takistamine muudab viiruse paljunemisvõimetuks. 2: Paindlik domeenide vaheline regioon, mis ühendab nsP2 valgu N-otsa poolset helikaasi ja C-otsa poolset proteaasi piirkondi, on CHIKV replikatsiooni jaoks samuti hädavajalik. Ainult väikesed muudatused selles piirkonnas, nagu ühe aminohappejäägi eemaldamine ja kuni 10 aminohappejäägi lisamine, ei mõjuta oluliselt viiruse replikatsiooni. Suuremad muudatused, nagu kolme või viie aminohappejäägi eemaldamine, inaktiveerivad viiruse. 3: G3BP/Rin seondumise motiivide sisestamine nsP2 paindlikesse (domeenide vahelistesse) piirkondadesse oli mitte ainult viiruse poolt talutav vaid ka funktsionaalselt efektiivne - sisestatud järjestus suutis toetada mutantse CHIKV replikatsiooni nii imetajate kui ka putukarakkudes. Samad motiivid taastasid viiruse, mille nsP3 valgus puudusid G3BP seondumise motiivid, võime paljuneda imetaja rakkudes.
The novel trans-complementation system for chikungunya virus
(Tartu Ülikool, 2024) Makhotina, Anna; Merits, Andres, juhendaja; Naumenko, Krystyna, juhendaja; Wang, Sainan, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Tehnoloogiainstituut
Alphaviruses (Togaviridae) are mosquito transmitted positive-sense RNA viruses that cause severe and sometimes even lethal diseases in their vertebrate hosts. Numerous outbreaks have been brought on by alphaviruses worldwide in the last few decades. Chikungunya virus (CHIKV) stands out as a major global health concern due to recurrent outbreaks and debilitating chronic arthralgia caused by CHIKV infection. The arthralgia might be due to the persistent replication of CHIKV. CHIKV non-structural protein 4 (nsP4) is the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), which enables the replication of the viral genome and therefore plays a critical role in virus infection. In this work, we established the inducible stable cell lines for CHIKV nsP4 expression. NsP4 expressed in these cells can functionally trans-complement CHIKV mutant genomes harboring lethal mutations in nsP4 or lacking the nsP4 region entirely. This system enables the production of CHIKV virions that are infectious for nsP4 expressing cell lines but limited to early stages of infection (attachment, internalization, and replicase protein expression) in other cells. Moreover, our system was found to be suitable for the analysis of compounds inhibiting CHIKV replication; for example, RdRp inhibitor 4’-Fluorouridine significantly inhibited viral replication in nsP4 expressing cells. Additionally, our study revealed that CHIKV nsP4 can form functional replicases with P123 polyproteins of heterologous alphaviruses using trans-replication assay. This finding expands the versatility of the CHIKV nsP4 stable cell lines. We extended these findings and constructed inducible cell lines that express both nsP1 and nsP4 components of replicase and demonstrated that these cells can complement for lethal defects introduced into both nsP1 and nsP4 of the CHIKV genome. Taken together, CHIKV nsP4 inducible stable cell lines are valuable tools for alphavirus research, can be used to produce virions that are infections only in specific cell lines and therefore be handled without biosafety risk, such tools open new possibilities for studies of alphavirus replication as well as for screening and analysis of inhibitors of alphavirus replication.
Towards understanding the neurovirulence of Semliki Forest virus
(2015-11-16) Saul, Sirle; Merits, Andres, juhendaja; Žusinaite, Eva, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja tehnoloogiateaduskond
Semliki Forest viirus (SFV) on positiivse polaarsusega RNA genoomiga viirus, mis kuulub alfaviiruste perekonda sugukonnas Togaviridae. Alfaviiruste seas leidub mitmeid inimese ja loomade patogeene, mille poolt põhjustatavad haigused varieeruvad külmetuse sarnaste sümptomitega tõvest aastaid kestva artriidi või fataalse entsefaliidini. SFV-d on laialdaselt kasutatud nii alusuuringutes kui ka mudelobjektina viirusliku entsefaliidiga kaasneva patogeneesi uurimisel. Kõige põhjalikumalt uuritud SFV tüvedeks on A7(74), SFV4 ja L10. A7(74) on avirulentne tüvi, mis põhjustab täiskasvanud hiires asümptomaatilist infektsiooni. SFV4 ja L10 on aga virulentsed tüved, sest otse ajju või kõrge doosiga kõhuõõnde süstituna põhjustavad nad hiirtel surmaga lõppevat entsefaliiti. Madalama viiruse koguse kasutamise korral ei jõua SFV4 ajju ning nakatatud katseloomad jäävad ellu. Käesolev uurimistöö näitas, et SFV4 ja L10 vahelised erinevused hiires on tingitud viiruse ümbrisevalgu (E2) aminohappejääkide laengutest. Positiivse laenguga lüsiinijäägid E2 valgus soodustavad küll viiruse seondumist koekultuuri rakkudele, kuid põhjustavad in vivo tingimustes SFV4 virionide efektiivse seostumise raku pinnaretseptori heparaansulfaadiga, mis vähendab viiruse taset veres ja selle kaudu võimekust ajju siseneda. Me näitasime, et erinevused A7(74) ja L10 neurovirulentsuses on tingitud erinevustest viiruse mittestruktuurse liitvalgu proteolüütilise lõikamise kiiruses ning mittestruktuurse valgu 3 (nsP3) järjestuses. P123 liitvalgu 1/2 lõikamisjärjestuse aeglane protsessimine või L10 nsP3 valgu olemasolu suurendavad SFV replikaasi võimet indutseerida interferooni tootmist, korreleerudes viiruse võimega levida hiire ajus, mis viitab seosele SFV neurovirulentsuse ja immunopatoloogia vahel. Viiruse ja peremehe vahel esinevate keeruliste interaktsioonide veel täpsemaks uurimiseks arendasime välja uue lähenemise, mis võimaldas tuvastada SFV replikatsioonikompleksidega seonduvaid rakulisi valke. Käesoleva uurimistöö käigus saadud tulemused aitavad ühelt poolt paremini mõista SFV neurovirulentsust, lisaks sellele on mudelviiruse uurimisel kasutatud meetode ja avastatud seaduspärasusi võimalik rakendada ka inimesele ohtlike alfaviiruste uurimiseks.
Unraveling the intricate nature of the alphavirus RNA replicase
(2023-06-30) Lello, Laura Sandra; Merits, Andres, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond
Alfaviirused on RNA genoomiga viiruste perekond, mille hulka kuulub olulisi inimeste haigustekitajaid. Imetajaid, linde ja roomajaid nakatavad alfaviirused võib jagada kaheks, millest esimesed põhjustavad artriidi-tüüpi sümptomeid ning teised neuroloogilisi haiguseid. Meditsiiniliselt on üks olulisemaid alfaviiruseid chikungunya viirus, mis põhjustab inimestes palavikku, löövet ning liigesevaegusi. Liigesevaegused võivad areneda kuude või isegi aastate pikkuseks artriidiks. Iga RNA genoomiga viiruse elutsükli keskne osa on RNA genoomi replikatsioon. Replikatsioon ehk viiruse genoomi paljundamine on seetõttu ka üks põhilisi elemente, mille vastu on suunatud vaktsiinide ning viirusvastaste vahendite loomine. Hoolimata alfaviiruste laiast levikust inimeste seas ei ole tänini saadaval heakskiidetud vaktsiine või viirusvastaseid vahendeid. Seetõttu on oluline uurida erinevate alfaviiruste RNA replikatsiooni toimumise põhimõtteid ning nõudeid. Alfaviiruste genoomi replikatsiooni viivad läbi neli spetsiaalset valku, mida kutsutakse replikaasi valkudeks. Nendest replikaasi valkudest moodustatakse rakkudes kompleksid, millesse koondatakse viiruse uute genoomide tootmine. Selles doktoritöös uuriti kümne erineva alfaviiruse näitel kõnealuste replikatsioonikomplekside moodustumist. Aktiivsete replikatsioonikomplekside moodustumise eelduseks on, et alfaviiruste replikaasid tunnevad rakus ära enda genoomi, seonduvad sellega ning alles siis on võimelised seda paljundama. Me näitasime, et mõnede alfaviiruste replikaasid suudavad inimese rakkudes ära tunda võõraste viiruste genoomidele omaseid järjestusi ning replitseerivad neid efektiivselt, samas kui osade viiruste replikaasid näitasid üles tugevat spetsiifilisust enda genoomi suhtes. Lisaks näitasime, et funktsionaalseid alfaviiruste replikatsioonikomplekse on võimalik moodustada replikaasi valkudest, mis pärinevad erinevatelt alfaviirustelt (st, moodustatakse hübriidsed replikaasid). Kasutades selliseid hübriidseid replikaase tuvastasime, millised replikaasi valgud oma genoomile spetsiifilisi elemente enne replikatsiooni alustamist ära tunnevad ning määravad, kas seda genoomi replitseerida või mitte. Samuti näitasime, et matriits-järjestusi, mis sisaldavad alfaviiruste genoomidele spetsiifilisi elemente ning ekspresseerivad reportereid, on võimalik aktiveerida reaalse viirusnakkuse korral. Selliseid biosensoreid hakatakse viirusnakkuse korral rakkudes tootma, mille tagajärjel on nakatunud rakke võimalik visuaalselt tuvastada rohelise värvuse järgi. Siin töös kogutud informatsiooni abil õnnestus viimaks määrata alfaviiruste replikaasi keskse osa, nsP4 valgu aktiivse subühiku 3D struktuur ning uurida selle struktuursete elementide olulisust mutageneesi abil. Selle doktoritöö raames läbi viidud uurimused annavad uut informatsiooni alfaviiruste replikatsiooni kohta. Hübriidsete replikatsioonikomplekside moodustumine annab aimu, mis võib toimuda alfaviiruste replikatsioonil juhul, kui ühte rakku on nakatanud mitu erinevat alfaviirust. Alfaviiruste replikaaside võime ära tunda võõrastele viirusgenoomidele spetsiifilisi elemente aitab pilgu heita ka alfaviiruste genoomide võimalikule rekombinatsioonile ning evolutsioonile.
Uudsete EGFP-d ekspresseerivate Semliki Forest viiruste iseloomustamine in vivo ja in vitro
(2006) Tamberg, Nele; Merits, Andres, juhendaja
Zika viiruse replikonide pakkimine viirus-replikon partiklitesse
(Tartu Ülikool, 2018) Usar, Siret; Merits, Andres, juhendaja; Žusinaite, Eva, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkond; Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut
Zika viiruse (ZIKV) replikoni pakkimiseks katsetati kolme erinevat pakkimissüsteemi. Nendeks olid SFV replikonidel, pakkimisrakuliinil ja viirus-replikon partiklitesse (VRP) pakitud SFV replikonil põhinev süsteem. Kõik kolm süsteemi põhinevad pakkimiseks vajalike ZIKV struktuursete valkude ekspressioonil in trans pakitava ZIKV replikoni suhtes. SFV replikonidel põhineva süsteemi puhul ekspresseeritakse ZIKV struktuursed valgud rekombinantselt SFV replikonilt ning pakkimisrakuliinil põhineva süsteemi korral stabiilselt rakuliini viidud vektorilt. SFV VRP-del põhinev süsteemi puhul saavutatakse ZIKV struktuursete valkude ekspressioon eelnevalt VRP-desse pakitud rekombinantselt SFV replikonilt. Kõigi kolme süsteemi ZIKV replikoni pakkimise efektiivsust hinnati ZIKV replikon-RNA-l kodeeritud markevalkude detekteerimisega. Käesoleva töö tulemustest selgus, et ainult VRP-desse pakitud SFV replikonil põhinev süsteem võimaldas efektiivselt pakkida ZIKV replikoni.